魚精蛋白凝聚法測定和厚樸酚脂質體的包封率

劉衛斌，薛彥寧，秦永剛（.陜西榆林市第二醫院，榆林市 79000；.陜西中藥研究所，咸陽市 7000）

魚精蛋白凝聚法測定和厚樸酚脂質體的包封率

劉衛斌1＊，薛彥寧1，秦永剛2（1.陜西榆林市第二醫院，榆林市 719000；2.陜西中藥研究所，咸陽市 712000）

目的：建立和厚樸酚脂質體包封率（EE）的測定方法。方法：以反相高效液相色譜法為分析手段，采用魚精蛋白凝聚法測定和厚樸酚脂質體EE。結果：和厚樸酚檢測濃度在2.006～160.512 mg·L-1范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 9），最低檢測限和最低定量限分別為1.4、4.0 ng；魚精蛋白凝聚法的平均回收率為（95.70±2.07）%，RSD＝1.71%（n＝9）；平均EE為85.87%。結論：魚精蛋白凝聚法操作簡單、可行、重現性好，適用于脂溶性藥物和厚樸酚脂質體EE的測定。

和厚樸酚脂質體；反相高效液相色譜法；包封率；魚精蛋白凝聚法

和厚樸酚為木蘭科落葉喬木植物厚樸Magnolia officinalisCortex的有效成分，是從厚樸中分離得到的具有生物活性的小分子物質。藥理學研究證明，和厚樸酚具有抗氧化[1]、抗焦慮[2]、抗菌[3]、抗血栓形成[4]和抗腫瘤[5～7]的作用。和厚樸酚水溶性差，幾乎不溶于注射用水，故影響了其在臨床中的應用。將和厚樸酚開發成脂質體劑型，可以解決其難溶問題，提高藥物穩定性、載藥量、靶向性及療效。脂質體還可能延長和厚樸酚在體內的循環時間，改善其在體內的吸收及分布。脂質體制備過程中，包封率（EE）是控制質量與篩選處方和工藝條件的重要指標之一。2005年版《中國藥典》（二部）規定，脂質體EE不得低于80%[8]，所以建立快速、準確的EE測定方法是研制脂質體重要的環節。本研究將以高效液相色譜（HPLC）法為分析手段，采用魚精蛋白凝聚法測定建立一種簡單、準確、可操作性強的測定和厚樸酚脂質體EE的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC2010型HPLC系統（日本島津公司）；AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

和厚樸酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110730-200408，純度≥99.0%）；和厚樸酚原料藥（西安融升生物科技有限公司，純度≥98.0%）；磷脂（成都科龍化工試劑廠，純度≥98.0%）；膽固醇（成都科龍化工試劑廠，純度≥98.0%）；聚乙二醇（PEG，成都科龍化工試劑廠，分子量：2 000）；魚精蛋白（美國Sigma公司，批號：YY15284）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（65∶35）；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：294 nm；進樣量：10 μL。理論板數按和厚樸酚色譜峰計算應不低于3 000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白脂質體；B.和厚樸酚脂質體；C.和厚樸酚對照品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank liposomes；B.honokiol liposomes；C.honokiol control

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取和厚樸酚對照品50.16 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成含和厚樸酚濃度為1.003 2 mg·mL-1的對照品溶液，冰箱4℃貯存，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取一定體積的和厚樸酚對照品溶液，用流動相稀釋成2.006 4、5.016、10.032、20.064、40.128、80.256、160.512 mg·L-1的溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣。以峰面積積分值（A）為縱坐標，和厚樸酚檢測濃度（C，mg·mL-1）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝16 400C－2 763（r＝0.999 9）。結果表明，和厚樸酚的檢測濃度在2.006～160.512 mg·L-1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3.2 精密度試驗 取5.016、20.064、80.256 mg·L-1的和厚樸酚對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件于日內（0、2、4、6、8、10 h）各時間點進樣分析，測定峰面積積分值，計算日內精密度。結果，3個濃度的RSD分別為0.29%、0.21%、0.15%（n均為6），表明日內精密度良好。取相同濃度的和厚樸酚對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件于日間（1、2、3、4、5 d）進樣分析，測定峰面積積分值，計算日間精密度。結果，3個濃度的RSD分別為1.92%、0.74%、1.59%（n均為6），表明日間精密度良好。

2.3.3 加樣回收率試驗 取空白脂質體溶液0.05 mL，置于2 mL EP離心管中，再分別加入7.5、30.0、120.0 μL濃度為1.003 2 mg·mL-1的和厚樸酚對照品溶液，加乙腈分別至1.5 mL，使和厚樸酚檢測濃度分別為5.016、20.064、80.256 mg·L-1，超聲1 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，每個濃度平行操作3份，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.3.4 最低檢測限和最低定量限測定 按“2.1”項下色譜條件，將2.0、1.0、0.5、0.1 mg·L-1的和厚樸酚對照品溶液分別進樣10 μL，記錄色譜圖。采用基線信號與噪聲比方法，以信號∶噪聲＝3∶1時的濃度為最低檢測限濃度；照《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》[8]，以信號∶噪聲＝10∶1時的濃度為最低定量限濃度。即最低檢測限和最低定量限分別為1.4、4.0 ng。

2.4 和厚樸酚脂質體的制備

采用薄膜超聲法，精密稱取磷脂-膽固醇-PEG（1∶0.3∶0.08，W/W）/W為總脂，將和厚樸酚-總脂（1∶4）加入到一定量裝有甲醇的圓底燒瓶中溶解，減壓蒸發成薄膜，加入一定量水進行水化處理，超聲處理，即得和厚樸酚脂質體。

2.5 粒徑和電位測定

取和厚樸酚脂質體溶液，用超純水稀釋，測定其粒徑大小和Zeta電位。結果，平均粒徑為93.84 nm，平均電位為－21.8 mV。

2.6 魚精蛋白凝聚法

采用魚精蛋白凝聚法分離游離藥物與脂質體。用移液槍精密吸取0.1 mL和厚樸酚脂質體于2 mL EP管中，加入10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液0.1 mL，渦旋60 s，靜置3 min，加入1 mL生理鹽水，混勻，室溫下以3 000 r·min-1離心30 min，沉淀脂質體。精密吸取上清液0.1 mL，以流動相稀釋后按“2.1”項下色譜條件測定，并計算游離藥物含量（C游）。

2.7 魚精蛋白凝聚法加樣回收率試驗

配制低、中、高濃度（0.106 1、0.285 6、0.641 5 mg·L-1）的游離和厚樸酚乙醇-水溶液，加入空白脂質體（粒徑約為100 nm），得混合脂質體混懸液。取上述脂質體混懸液0.1 mL，添加0.1 mL 魚精蛋白（10 mg·mL-1），攪勻，靜置3 min，加入1.0 mL生理鹽水，3 000 r·min-1離心30 min，沉淀脂質體。精密吸取上清液0.1 mL，以流動相稀釋后按“2.1”項下色譜條件測定，并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 魚精蛋白凝聚法加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of protamine aggregation method（n＝9）

2.8 和厚樸酚脂質體EE測定

按“2.1”項下色譜條件，測定“2.4”項下制得的和厚樸酚脂質體中和厚樸酚含量（C總），并根據下式計算和厚樸酚脂質體EE：EE＝（C總－C游）/C總×100%。結果，和厚樸酚在脂質體中的EE可達到80%以上，平均值為85.87%，詳見表2。

表3 和厚樸酚脂質體EE測定結果Tab 3 Encapsulation efficiency of honokiol liposomes

3 討論

為準確測定脂質體EE，將脂質體和游離藥物分離是關鍵步驟。本試驗曾采用SephadexG-50凝膠柱層析法分離脂質體與游離和厚樸酚，因為和厚樸酚不溶于水，當用pH 7.4的PBS進行洗脫時，游離和厚樸酚截留在凝膠柱頂端，待脂質體完全洗出柱子后，截留在柱子頂端的游離和厚樸酚緩慢被洗出凝膠柱，色譜峰很寬且不規則，洗脫時間很長，測定不準確。本試驗也曾采用透析法，此法雖操作簡單，但耗時較長，且重復性不好，故該方法有待考察。超速離心法對離心機轉速要求較高，儀器耗費較大，離心時間通常需要1 h以上，方法成本較高。和厚樸酚水溶性差，而凝膠柱分離法、透析法、超濾法等都是用于分離水溶性藥物。為了探討一種簡單、速效、準確的脂質體EE的測定方法，本試驗建立了魚精蛋白絮凝-離心法分離脂質體，以RP-HPLC法為分析手段，測定脂質體藥物EE。

魚精蛋白的最大特點就是堿性氨基酸占有較大比例[9]，其等電點為10～12，可溶于水和稀酸，熱穩定性較好。本文所用魚精蛋白是鮭魚精蛋白（salmine），約含2/3以上的精氨酸。精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸，帶正電，正是由于這些帶有正電荷的胍基的大量存在，多聚陽離子魚精蛋白會與帶負電或中性的脂質體產生絮凝作用，常規離心即可將脂質體和游離藥物分離。因此，它是一種針對脂質體電荷性質的凝聚離心法，具有快速、可操作性強的優點。魚精蛋白凝聚法的適用范圍比較廣泛，可以測定不同溶解性質藥物脂質體的EE，但此法也存在一定的局限性：脂質體的Zeta電位對魚精蛋白凝聚法測定脂質體EE有一定影響，它更適于中性或負電荷脂質體的分離。

[1]Ogata M，Hoshi M，Shimotohno K.Antioxidant activity of magnolol，honokiol，and related phenolic compounds[J].J Am OilChem Soc，1997，74（5）：557.

[2]Kuribara H，Kishi E，Hattori N.Application of the elevated plus-maze test in mice for evaluation of the content of honokiol in water extracts of magnolia[J].Phytother Res，1999，13（7）：593.

[3]Syu WJ，Shen CC，Lu JJ，et al.Antimicrobial and cytotoxic activities of neolignans from Magnolia officinalis[J].Chem Biodivers，2004，1（3）：530.

[4]Pyo MK，Lee Y，Yun-Choi HS.Anti-platelet effect of the constituents isolated from the barks and fruits of Magnolia obovata[J].Arch Pharm Res，2002，25（3）：325.

[5]Yang SE，Hsieh MT，Tsai TH，et al.Downmodulation of Bcl-XL，release of cytochrome c and sequential activation of caspases during honokiol-induced apoptosis in human squamous lung cancer CH27 cells[J].Biochem Pharmacol，2002，63（9）：1 641.

[6]Wang T，Chen F，Chen Z，et al.Honokiol induces apoptosis through p53-independent pathway in human colorectal cell line RKO[J].World J Gastroenterol，2004，10（15）：2 205.

[7]Hirano T，Gotoh M，Oka K.Natural flavonoids and lignans are potent cytostatic agents against human leukemic HL-60 cells[J].Life Sci，1994，55（13）：1 061.

[8]Bai X，Cerimele F，Ushio-Fukai M，et al.Honokiol，a small molecular weight natural product，inhibits angiogenesis in vitro and tumor growth in vivo[J].J Biol Chem，2003，278（37）：35 501.

[9]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄181、附錄172.

[10]Sun P，Wang ZH ，Zheng MX.The research of protamine and application in food industry[J].Food Res Develop，2003，4（2）：15.

Determination of Encapsulation Efficiency of Honokiol Lipsomes by Protamine Aggregation Method

LIU Wei-bin，XUE Yan-ning（Yulin Municipal Second Hospital of Shaanxi Province，Yulin 719000，China）
QIN Yong-gang（Shaanxi Institute of Chinese Materia Medica，Xianyang 712000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of encapsulation efficiency（EE）of honokiol liposomes.METHODS：RP-HPLC method was adopted for the analysis of honokiol liposomes.Protamine aggregation method was applied to determinate the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.RESULTS：The linear range of honokiol was 2.006～160.512 mg·L-1.The limits of detection and quantitation were 1.4 ng and 4.0 ng，respectively.The mean recovery rate of protamine aggregation method was（95.70±2.07）%（RSD＝1.71%，n＝9）.The mean encapsulation efficiency of honokiol liposomes was 85.87%.CONCLUSION：The protamine aggregation method is simple，practical and reproducible for determination of the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.

Honokiol liposomes；RP-HPLC；Encapsulation efficiency；Protamine aggregation method

R283.2；283.69

A

1001-0408（2010）39-3695-03

＊主任藥師。研究方向：中藥學。電話：0912-3362085。E-mail：leibaolin@163.com

2010-06-16

2010-08-27）