細胞移植及軟骨組織工程技術在關節(jié)軟骨損傷臨床應用進展

林楨 鄭秋堅 鄭銘豪

·綜述·

細胞移植及軟骨組織工程技術在關節(jié)軟骨損傷臨床應用進展

林楨 鄭秋堅 鄭銘豪

細胞移植和軟骨組織工程技術是治療關節(jié)軟骨損傷的新方法，也是當今國內外關節(jié)骨科的研究熱點。本文綜述了國際上各種細胞移植和組織工程技術在關節(jié)軟骨損傷臨床的應用，包括軟骨細胞移植技術、聯(lián)合組織工程支架的軟骨細胞移植技術和干細胞移植技術，著重介紹了各種技術的特點和臨床應用現狀及進展，以期為國內軟骨損傷治療技術選擇提供思路。

細胞移植; 軟骨修復; 組織工程; 軟骨細胞

關節(jié)軟骨損傷是臨床常見的骨科疾病，由于關節(jié)軟骨本身缺乏修復機制，在損傷后難以恢復原有的組織結構，因此在治療上存在很大困難。軟骨在損傷后暴露軟骨下骨的血管、神經，引起關節(jié)疼痛及部分關節(jié)功能障礙，進一步發(fā)展成骨性關節(jié)炎，最后患者不得不接受人工關節(jié)置換。多年來，科學家們不斷地研發(fā)探討關節(jié)損傷的治療方案，希望能夠修復損傷的關節(jié)軟骨組織。傳統(tǒng)的軟骨修復方法主要是微骨折術或軟骨下骨鉆孔，術后軟骨下骨骨髓腔內的干細胞滲透到軟骨損傷部位，啟動軟骨修復機制。但是這種干細胞的滲透缺乏足夠有效的引導，修復形成纖維軟骨為主的混合組織，無法恢復關節(jié)軟骨本身的組織結構，臨床效果并不理想。近年來，由于組織工程技術的發(fā)展，關節(jié)損傷修復的治療有了許多突破。特別是以細胞治療為主的組織工程技術，給關節(jié)損傷患者提供了更多的機會。現將國際上與細胞治療有關的軟骨組織工程技術修復關節(jié)軟骨損傷的臨床現狀和進展介紹如下。

1 軟骨細胞移植技術

1.1 自體軟骨細胞移植技術

自體軟骨細胞移植(autologous chondrocyte implantation/transplantation，ACI/ACT)技術在1987年由一名瑞典醫(yī)生首次在臨床上應用于軟骨損傷修復。該技術主要包括三方面內容:(1)通過關節(jié)鏡檢查，檢查并確診缺損部位后，從患者關節(jié)非負重區(qū)采取一小片關節(jié)軟骨，在無菌條件下送到細胞培養(yǎng)室;(2)應用酶消化等方法分離軟骨細胞，在體外加入軟骨細胞培養(yǎng)基及動物血清進行增殖培養(yǎng)，以獲取足夠數量的細胞;(3)通過開放手術暴露關節(jié)損傷部位，修整創(chuàng)口，將含有一定數量的軟骨細胞懸液注射到創(chuàng)面，然后用自體骨膜或膠原蛋白膜覆蓋并縫合。該技術為第一代的組織工程化軟骨技術。

多個臨床隨訪研究證明，ACI修復非感染性關節(jié)軟骨缺損的早期療效較為滿意。1994年首個臨床隨訪報道，23例髖關節(jié)軟骨損傷患者經過ACI治療，結果87%達到優(yōu)良，活組織病理學檢查發(fā)現其中73%的患者呈現透明樣軟骨生成［1］。2001年，該作者報道了ACI治療213例髖關節(jié)股骨端不同程度損傷的患者2～10年隨訪結果，有84%～90%的患者效果達到良好或優(yōu)秀［2］。1997年，美國食品藥品管理局通過了ACI的臨床準入申請，并進行了一項多中心臨床應用研究，有19個醫(yī)療中心的50例膝關節(jié)軟骨損傷患者接受了ACI治療，患者平均年齡為36歲，關節(jié)軟骨缺損評估Ⅲ～Ⅳ度，平均缺損面積為4.2 cm2，經過3年以上隨訪，手術成功率達94%［3］。另外，不同損傷部位的比較研究發(fā)現，ACI對髕股關節(jié)面的修復效果較差，這可能與髕骨運動軌跡紊亂影響關節(jié)面軟骨修復有關［4］。

Bentley等［5］對100例膝關節(jié)軟骨損傷患者進行ACI(58例)與骨－軟骨移植(42例)的前瞻性臨床隨機對照研究，患者平均年齡為31.2歲，平均軟骨缺損面積為4.66 cm2，結果ACI技術的優(yōu)良率為88%，而骨－軟骨移植的優(yōu)良率為69%，其中5例用骨－軟骨移植治療髕骨關節(jié)面缺損者均失敗。他們認為ACI明顯優(yōu)于骨－軟骨移植。

但是，也有報道顯示ACI的返修率高達15%～30%［6］，說明該技術仍存在一定的缺點。首先，骨膜腫脹是最常見的術后并發(fā)癥，由此引起患者術后康復效果不良、關節(jié)疼痛不緩解等。再次，研究證明，軟骨細胞在體外增殖的過程中發(fā)生去分化，軟骨細胞表型向成纖維細胞轉變，透明軟骨基質的主要成分Ⅱ型膠原蛋白基因表達減少，而纖維軟骨的主要成分Ⅰ型膠原纖維基因表達增加［7］。細胞在機體外表型的改變，可能影響細胞移植到體內分泌軟骨基質的功能，從而影響修復效果。最后，全層關節(jié)軟骨缺損部位通常具有一定的厚度，傳統(tǒng)ACI技術單純使用軟骨細胞懸液注射，無法保證三維結構的完整填充和構建。

1.2 同種異體軟骨細胞移植技術

實驗表明，軟骨基質的抗原性很低，同種異體的軟骨細胞在基質的保護下僅能引起輕微的免疫反應［8］。因此，有人提出了用同種異體的軟骨細胞作為軟骨缺損修復的種子細胞，可制成現成的組織工程化軟骨產品。

DeNovo ET技術(Zimmer Inc，荷蘭;IN/ISTO Technologies Inc，美國)利用胚胎來源的軟骨細胞，在體外經過增殖培養(yǎng)后，結合具有生物相容性的軟骨引導/誘導基質，用于軟骨缺損修復［9］。實驗證明，來自新生兒或胚胎的軟骨細胞較成人軟骨細胞更能有效地生成Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖等軟骨基質，有利于軟骨修復［10］。該技術利用胚胎軟骨細胞，制成現成的軟骨修復產品，將可望用于一期手術治療，但目前還處于臨床前期試驗階段。

隨后，該公司又推出了DeNovo NT技術，結合軟骨碎片技術和同種異體胚胎軟骨組織的概念，在無菌條件下將來源于胚胎的軟骨組織切碎，平鋪到軟骨缺損區(qū)，利用纖維膠固定。由于該技術無需添加任何未經許可的生物材料、組織消化酶或細胞培養(yǎng)基，因而無需通過美國食品藥品管理局的市場前期認證，已經有超過70例的患者接受治療［11］。

另外還有人提出建立軟骨組織庫，從新鮮尸體上獲得軟骨組織，在體外分離細胞，經培養(yǎng)后置于低溫保護液及液氮內可保存較長時間［12-13］。在需要時，可對細胞進行復蘇，結合組織工程技術用于軟骨損傷的一期治療［9］。Almqvist等［14］報道了運用成人異體軟骨細胞結合藻酸鹽載體治療21例膝關節(jié)軟骨損傷患者的結果，證明了該技術的可行性和安全性。該方法可解決軟骨組織來源稀少的問題，但在倫理學審核及潛在疾病傳染等問題上仍需謹慎考慮。

2 聯(lián)合組織工程支架的軟骨細胞移植技術

為了克服第一代ACI技術存在的諸多缺點，科學家們以建立三維的軟骨樣組織為出發(fā)點，結合軟骨細胞及各種組織工程支架構建組織工程化軟骨。利用生物材料作為軟骨細胞體外培養(yǎng)和體內填充的臨時載體，除了可以用于修復缺損軟骨的三維結構之外，還能支持細胞的生長、擴增和分化。實驗證明，在三維結構中培養(yǎng)有利于保持軟骨細胞的生物表型，克服其在二維平面培養(yǎng)過程的去分化［15］。

組織工程生物支架開發(fā)是第二代軟骨細胞移植的核心技術，目前正引起國內外廣泛的關注。為了尋找修復軟骨損傷最佳的生物支架，開發(fā)安全有效的第二代軟骨細胞移植技術，研究者開展了大量的動物實驗和臨床研究。目前，已經投入到臨床應用的主要有下列幾種產品，見表1。

表1 軟骨細胞結合組織工程支架的商業(yè)化產品及技術特點

2.1 基質誘導的自體軟骨細胞移植

基質誘導的自體軟骨細胞移植(matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI?)技術由德國Verigen公司開發(fā)，后由美國Genzyme公司收購，在美國、澳大利亞及歐洲多個國家臨床應用，全球治療關節(jié)軟骨損傷患者超過5000例，是目前臨床應用最為廣泛的第二代軟骨細胞移植技術。該技術主要采用Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白生物膜作為細胞支架。該生物膜具有雙層結構，粗糙面的纖維排列較為稀疏，供軟骨細胞粘附、生長、遷徙，及營養(yǎng)滲透;光滑面纖維結構較致密，植入時面向關節(jié)腔，修復關節(jié)軟骨的光滑表面。結合關節(jié)鏡技術，把細胞－生物膜復合物覆蓋到軟骨缺損區(qū)域，然后用纖維生物膠(fibrin glue)固定。該技術利用生物膜代替骨膜，減少了縫合步驟，結合關節(jié)鏡技術，有效縮短了手術時間，減少手術創(chuàng)傷。Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白膜為軟骨細胞提供了合適的生長微環(huán)境，避免細胞去分化，保持較好的軟骨細胞表型［16］。另外，纖維生物膠除了作為生物膜與基底的粘合劑之外，還可以促進軟骨細胞的蛋白基質分泌和遷移［17］。

Cherubino等［18］在2003年率先報道了MACI?后6個月的短期隨訪結果，顯示MACI?治療可明顯改善患者關節(jié)功能，MRI檢查提示透明樣軟骨修復，同時未發(fā)現任何術后并發(fā)癥。Bartlett等［19］報道6個月到1年的隨訪結果也證實MACI?可有效修復膝關節(jié)全層骨軟骨缺損。12例患者3年隨訪結果提示中期MACI?治療效果良好［16］。術后并發(fā)癥包括植入物增生、脫落，以及關節(jié)僵硬等［20-21］。

ACI與MACI?的前瞻性隨機對照研究發(fā)現，ACI組(44例)患者術后優(yōu)良率為79.2%，MACI?組(47例)為66.6%;在術后1年組織學檢查為透明樣軟骨或透明樣軟骨與纖維軟骨混合組織分別為ACI組43.9%和MACI?組36.4%;術后并發(fā)組織增生ACI組有9%，MACI?組有6%;兩組的返修率均為9%［20］。MACI?組與微骨折組術后2年MRI復查提示MACI?能夠較好地修復和填充軟骨缺損區(qū)域，臨床功能恢復評價也較微骨折組好［22］。

2.2 Hyalograft?C

Hyalograft?C是一種基于以透明質酸為主要成分的生物支架的組織工程化軟骨產品。透明質酸是關節(jié)透明軟骨基質中的主要蛋白成分。許多研究證明透明質酸可以支持軟骨細胞分化，促進細胞Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖基因表達，同時促進細胞增殖［23-25］。Hyalograft?C采用HYAFF?11(Fidia Advanced Biopolymers Laboratories，意大利)作為軟骨細胞載體。該材料的主要成分為透明質酸芐酯，由20μm粗的纖維組成孔隙結構，可有效支持細胞聚集生長，維持軟骨細胞表型，促進細胞間通訊和細胞基質沉積［24，26］。

臨床研究結果表明，Hyalograft?C治療的軟骨損傷患者，生活質量提高率達94%，關節(jié)功能提高率為87%，修復組織呈透明樣軟骨［27］。Gobbi等［28］報道了Hyalograft?C治療髕股關節(jié)全層軟骨損傷的臨床應用結果，共34例患者5年隨訪期限，平均軟骨損傷面積4.45 cm2，術前國際軟骨修復協(xié)會(International Cartilage Repair Society，ICRS)評分Ⅲ～Ⅳ級。術后5年91.7%的患者關節(jié)功能主觀評分達到正常或接近正常水平。其中有8例患者接受術后關節(jié)鏡復查，組織學檢查提示透明樣軟骨修復。

除了用于治療關節(jié)軟骨局限性損傷之外，還有報道提示Hyalograft?C可能用于治療早期慢性骨關節(jié)軟骨退行性變。Nehrer等［29］進行了一項為期3年的隨訪研究，36例慢性膝關節(jié)損傷患者在術后1年關節(jié)功能即可改善。其中單個損傷患者功能恢復情況明顯優(yōu)于多個損傷者，對年輕患者的治療效果也較好。最近，還有文獻報道了應用Hyalograft?C技術治療大面積軟骨缺損的臨床病例。1例17歲急性白血病患者經過大劑量激素治療后出現股骨遠端和脛骨近端缺血性壞死。關節(jié)鏡探查發(fā)現軟骨下骨塌陷，內側股骨髁軟骨損傷面積達14 cm2。一期手術鉆孔減壓并取部分軟骨組織做體外增殖培養(yǎng)。5個月后行二期手術，對損傷關節(jié)面行Hyalograft?C修復。術后隨訪5.5年，患者膝關節(jié)癥狀明顯改善，可進行日?；顒蛹斑m量運動，MRI檢查顯示內側股骨髁關節(jié)軟骨牢固［30］。Hyalograft?C技術術后并發(fā)癥包括組織增生(2例)、關節(jié)僵硬(1例)和滑膜炎(1例)［31］。

2.3 Bioseed?-C

Bioseed?-C通過從患者身上分離軟骨細胞，培養(yǎng)增殖后與改良的纖維蛋白凝膠混合，用于治療關節(jié)軟骨損傷，或與角質細胞混合治療皮膚創(chuàng)傷。

纖維蛋白來源于血液中，一般情況下纖維蛋白原呈液態(tài)存在，經激活后形成具有多孔網狀結構的固態(tài)聚合凝膠。其在創(chuàng)傷愈合過程中是一種天然的細胞生長支架，可提供細胞附著生長的場所。纖維蛋白凝膠還可作為軟骨細胞載體構建不同形狀的軟骨組織［32］。天然的纖維蛋白凝膠容易被生物酶降解，且機械強度不足。Bioseed?C利用經過化學改造的纖維蛋白膠，添加丙交脂/乙交脂共聚物和二氧雜環(huán)己酮，增加纖維蛋白的機械強度，降低降解速率，提高穩(wěn)定性［33］。

Kreuz等［34］近期報道了19例Bioseed?-C治療膝關節(jié)創(chuàng)傷性軟骨損傷患者(放射學檢查確診骨性關節(jié)炎)4年臨床隨訪結果。結果在術后6個月，患者的ICRS和Lysholm評分顯著提高。MRI檢查顯示有6例軟骨損傷區(qū)域填充完全，顯示正?；虿糠指咝盘枴?例術后癥狀無改善患者4年后行全膝關節(jié)置換。研究提示該技術可作為治療早期關節(jié)軟骨退行性變的一種方法。

Niemeyer等［35］總結了309例用ACI(骨膜覆蓋52例，14.9%;膠原蛋白膜覆蓋215例，61.6%)或Bioseed?-C(82例，23.5%)治療膝關節(jié)軟骨損傷患者臨床資料，對術后并發(fā)癥及失敗病例進行回顧。最主要的術后并發(fā)癥包括植入物增生、新生軟骨與周圍正常軟骨組織融合不良、軟骨再生不足，以及植入物脫落等。據統(tǒng)計，植入物增生的總發(fā)生率為5.2%，但骨膜覆蓋的ACI治療患者發(fā)生率為15.4%。新生軟骨與周圍正常軟骨組織融合不良主要發(fā)生在膠原蛋白膜覆蓋的ACI(3.7%)和Bioseed?-C(4.8%)治療的患者。另外，髕骨關節(jié)面軟骨損傷的修復術后并發(fā)癥較高，特別是植入物增生。另一項Bioseed?-C (42例)與第一代ACI技術(40例)的臨床對照研究結果顯示，兩組患者術后5年臨床癥狀均顯著緩解。平均Lysholm評分Bioseed?-C治療患者從47分提高到78分，ACI治療患者從33分提高到70分，兩組關節(jié)功能提高差異無統(tǒng)計學意義。因此認為Bioseed?-C治療膝關節(jié)軟骨損傷的中期臨床效果與ACI相當，且術后不良反應較ACI少［36］。

2.4 CaReS?

CaRes?又稱為軟骨再生系統(tǒng)(cartilage regeneration system)，是利用患者自體軟骨細胞與Ⅰ型膠原蛋白膠在體外共同培養(yǎng)，通過模具塑形形成的凝膠狀產品。細胞培養(yǎng)用血清來源于患者，克服了使用動物血清可能導致疾病傳播等弊端。培養(yǎng)周期約為2周，植入時用纖維膠固定。該技術目前已進入中國，在天津完成生產凈化車間的建設，正在一些醫(yī)院進行小樣本的臨床試驗。

2006年，Andereya等［37］報道了CaRes?臨床應用結果，14例股關節(jié)損傷患者平均修復缺損面積6 cm2，平均手術切口長度8.2 cm。經過2年隨訪，關節(jié)功能均有提高，84.6%的患者達到優(yōu)良。2007年該作者又報道了該技術在修復髕股關節(jié)軟骨缺損的應用，14例患者隨訪2年，優(yōu)良率達78.6%［38］。

2.5 Cartipatch?

Cartipatch?利用具有溫度敏感性的水凝膠作為自體軟骨細胞的載體。水凝膠的主要成分為瓊脂糖和藻酸鹽，在25℃左右呈液態(tài)，可與細胞懸液混合，當溫度上升到37℃時形成凝膠狀。手術操作時，通過微創(chuàng)切口在器械的協(xié)助下將1至數個細胞－水凝膠載體以鑲嵌模式覆蓋到軟骨缺損表面。

Cartipatch?在法國進行了一項前瞻性多中心臨床研究，入組17例患者，隨訪2年。證實該技術可用于治療缺損面積超過3 cm2的全層關節(jié)軟骨缺損，62%(8/13)的患者可見透明樣軟骨生成［39］。

其他已經在全球各個地區(qū)進入臨床應用的組織工程化軟骨產品還包括Novocart?3D［40］和BioCartⅡ［29］等。各種不同組織工程生物支架聯(lián)合軟骨細胞移植技術在多個國家和地區(qū)進入臨床應用，近期效果雖然樂觀，但是大部分的文獻報道樣本數量較少，隨訪年限短，遠期療效尚不明確。同時，多中心隨機對照研究的報道結果偏少，僅有少數傳統(tǒng)修復技術與不同組織工程化軟骨技術隨機對照的循證醫(yī)學證據。

在技術上，軟骨細胞移植技術均采用一期關節(jié)鏡下獲取患者新鮮軟骨，在體外分離增殖培養(yǎng)的自體軟骨細胞后，二期手術植入細胞－載體復合物行缺損修復。細胞的培養(yǎng)周期一般需要2周，耗時較長，操作繁瑣，實際操作需要外科醫(yī)生、細胞生物學家與器械設備的緊密配合。生物支架通常也比較昂貴，臨床推廣存在一定的難度。組織修復以纖維軟骨或透明樣軟骨與纖維軟骨混合為主，無法完全恢復關節(jié)透明軟骨典型的層狀分布組織結構。

3 干細胞移植技術

組織工程化軟骨技術有兩個核心問題，一個是生物支架材料的選擇，另一個是種子細胞來源。除了自體或異體的軟骨細胞外，研究者對間充質干細胞修復軟骨的潛能也進行了大量的研究［41-43］。間充質干細胞是一種具有多分化潛能的原始細胞。間充質干細胞來源較軟骨細胞豐富，在臍血或成人骨髓中大量存在，在一些成體組織例如骨膜、肌肉、脂肪組織、軟骨組織和滑膜組織中也有［44-48］。因此，間充質干細胞，特別是骨髓來源的間充質干細胞也可作為關節(jié)軟骨缺損組織工程修復的種子細胞。

成人骨髓中除了間充質干細胞外，還有許多其他的細胞成分。一般來說，人們傾向于分離出單純的間充質干細胞，在體外經過擴增后配合生物載體植入體內［49-50］。Wakitani等［51］報道利用體外擴增的骨髓間充質干細胞結合膠原蛋白膠載體修復內側股骨髁軟骨損傷的臨床對照試驗?？偣?4例膝關節(jié)炎行高位脛骨截骨術患者，實驗組(12例)從髂前上棘行骨穿取骨髓后離心分離出有核細胞，在二維平面培養(yǎng)增殖，細胞達到一定數量后與可溶性Ⅰ型膠原蛋白混合后固化成膠狀，之后通過開放手術植入到損傷部位;對照組使用空白膠原蛋白膠對照。結果顯示兩組患者在功能改善方面無明顯差異，但是實驗組的關節(jié)鏡檢查和組織學檢查結果明顯優(yōu)于對照組。

另外還有學者提出，組織修復除了需要特定的細胞類型和載體之外，還要求特定的生物微環(huán)境，包括細胞間通訊、生長因子、細胞因子和其他類型細胞的參與，調節(jié)間充質干細胞分化和神經血管生成。骨髓中的造血干細胞等其他類型細胞和體液因子正是扮演這樣的角色，協(xié)助間充質干細胞完成組織修復過程［52-53］。在這樣的理論基礎上，有人提出了應用含有多種細胞成分的濃縮骨髓有核細胞作為關節(jié)軟骨修復的細胞來源［54］。

Giannini等［55］首先將該技術應用于臨床進行了一項前瞻性的研究，入組距骨骨軟骨損傷患者48例，隨訪超過24個月。首先，從患者的髂骨上棘穿刺獲得大約60 mL的全骨髓液，利用一個細胞分離濃縮器過濾掉骨髓中的大部分血清和紅細胞，分離出包括間充質干細胞、造血干細胞、單核細胞及淋巴細胞在內的有核細胞。然后，細胞與膠原蛋白粉劑及富含血小板的纖維膠混合，形成膠凍狀;或與透明質酸膜結合，填補關節(jié)骨軟骨缺損。研究結果提示，該技術可用于修復踝關節(jié)骨軟骨缺損，患者術后關節(jié)功能均有所提高，MRI檢查可見缺損填充，活組織病理學檢查顯示纖維軟骨及大量蛋白聚糖生成。該技術可避免體外細胞增殖培養(yǎng)等步驟，在一期手術中即可完成自體骨髓細胞的采集和植入，減少多次侵入性操作給患者造成的創(chuàng)傷，大大縮短了患者等候時間，也減少了治療費用。

干細胞的應用可克服軟骨組織缺乏、軟骨細胞表型不穩(wěn)定等問題。但在細胞分化調節(jié)和穩(wěn)定性維持方面還需要進一步研究。結合細胞因子或生長因子定向誘導干細胞分化，可維持細胞的活性和正常功能。一方面可以通過轉基因技術，在基因水平上對細胞進行修飾，使其向軟骨細胞定向分化并保持長久的穩(wěn)定功能［56］;另一方面通過改造細胞支架的組分，改變孔隙大小，控制細胞因子的釋放速度等［57］。

經過近30年的探索，組織工程化軟骨技術在臨床的應用日趨成熟，成為國內外業(yè)者研究討論的熱點。在國際上，特別是歐美發(fā)達國家的臨床醫(yī)生與研究人員不斷開拓創(chuàng)新，給我們提供了許多值得借鑒的知識與經驗。技術的臨床應用伴隨著臨床問題的不斷發(fā)現，又給研究者提出新的要求、提供新的思路，從而促進新技術的不斷涌現。組織工程化軟骨技術在國內的發(fā)展還相對落后，部分研究人員局限于對國外現有技術的重復驗證。加上國內醫(yī)療環(huán)境的限制，新技術臨床試驗等倫理規(guī)范的不完善，使得組織工程學研究成果在臨床的應用難以發(fā)展。組織工程學的臨床推廣，需要臨床從業(yè)者和基礎研究人員的緊密合作，配備符合衛(wèi)生安全規(guī)范的生物產品生產車間;需要專職部門從患者安全及技術創(chuàng)新等方面考慮制定有效可行的技術規(guī)范，對基礎研究和臨床應用進行指導與管理。

盡管當前組織工程化軟骨技術在一定程度上解決了軟骨損傷引起關節(jié)功能障礙等問題，但是仍未完全復原關節(jié)透明軟骨特有的組織結構和成分分布。重建具備關節(jié)軟骨特異性的層狀結構仍然是一大難題。國際上，更為前沿的研究隊伍除了關注關節(jié)的功能修復外，更多立足于細胞水平和分子水平探討軟骨組織的修復機制，希望通過改善種子細胞來源，提高生物載體的生物力學特性及生物相容性，精細調控細胞的增殖、分化和成熟等手段優(yōu)化組織工程化軟骨技術。隨著人們對關節(jié)軟骨生物特性及修復機制越來越多的認識，我們相信在可以預見的未來，一定能夠開發(fā)出理想的組織工程修復技術及其產品，為關節(jié)軟骨損傷患者造福。

1 Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，et al.Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation［J］.N Engl JMed，1994，331(14):889-895.

2 Brittberg M，Tallheden T，Sjogren-Jansson B，et al.Autologous chondrocytes used for articular cartilage repair:an update［J］.Clin Orthop Relat Res，2001，391(Suppl):S337-S348.

3 Micheli LJ，Browne JE，Erggelet C，et al.Autologous chondrocyte implantation of the knee:multicenter experience andminimum 3-year follow-up［J］.Clin JSport Med，2001，11(4):223-228.

4 Henderson IJ，Lavigne P.Periosteal autologous chondrocyte implantation for patellar chondral defect in patients with normal and abnormal patellar tracking［J］.Knee，2006，13(4):274-279.

5 Bentley G，Biant LC，Carrington RW，etal.A prospective，randomised comparison of autologous chondrocyte implantation versusmosaicplasty for osteochondral defects in the knee［J］.J Bone Joint Surg Br，2003，85(2):223-230.

6 Wood JJ，Malek MA，Frassica FJ，et al.Autologous cultured chondrocytes:adverse events reported to the United States Food and Drug Administration［J］.JBone Joint Surg Am，2006，88(3):503-507.

7 Lin Z，Willers C，Xu J，et al.The chondrocyte:biology and clinical application［J］.Tissue Eng，2006，12(7):1971-1984.

8 Osiecka-Iwan A，Hyc A，Moskalewski S.Immunosuppression and rejection of cartilage formed by allogeneic chondrocytes in rats［J］.Cell Transplant，1999，8(6):627-636.

9 Hettrich CM，Crawford D，Rodeo SA.Cartilage repair:third-generation cell-based technologies—basic science，surgical techniques，clinical outcomes［J］.Sports Med Arthrosc，2008，16(4):230-235.

10 Adkisson HD，Gillis MP，Davis EC，et al.In vitro generation of scaffold independent neocartilage［J］.Clin Orthop Relat Res，2001，391(Suppl):S280-S294.

11 McCormick F，Yanke A，Provencher MT，et al.Minced articular cartilage—basic science，surgical technique，and clinical application［J］.Sports Med Arthrosc，2008，16(4):217-220.

12 Almqvist KF，Wang L，Broddelez C，etal.Biological freezing of human articular chondrocytes［J］.Osteoarthritis Cartilage，2001，9(4): 341-350.

13 Xia Z，Murray D，Hulley PA，etal.The viability and proliferation of human chondrocytes following cryopreservation［J］.JBone Joint Surg Br，2008，90(9):1245-1248.

14 Almqvist KF，Dhollander AA，Verdonk PC，et al.Treatment of cartilage defects in the knee using alginate beads containing human mature allogenic chondrocytes［J］.Am JSports Med，2009，37(10): 1920-1929.

15 Schulze M，Kuettner KE，Cole AA.Adulthuman chondrocytes in alginate culture.Preservation of the phenotype for further use in transplantationmodels［J］.Orthopade，2000，29(2):100-106.(in German).

16 Gigante A，Bevilacqua C，Ricevuto A，et al.Membrane-seeded autologous chondrocytes:cell viability and characterization at surgery［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2007，15(1):88-92.

17 Kirilak Y，Pavlos NJ，Willers CR，etal.Fibrin sealant promotesmigration and proliferation of human articular chondrocytes:possible involvement of thrombin and protease-activated receptors［J］.Int JMol Med，2006，17(4):551-558.

18 Cherubino P，Grassi FA，Bulgheroni P，et al.Autologous chondrocyte implantation using a bilayer collagen membrane:a preliminary report［J］.JOrthop Surg(Hong Kong)，2003，11(1):10-15.

19 BartlettW，Gooding CR，Carrington RW，etal.Autologous chondrocyte implantation at the knee using a bilayer collagen membrane with bone graft.A preliminary report［J］.JBone Joint Surg Br，2005，87 (3):330-332.

20 BartlettW，Skinner JA，Gooding CR，et al.Autologous chondrocyte implantation versusmatrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee:a prospective，randomised study［J］.JBone Joint Surg Br，2005，87(5):640-645.

21 Behrens P，Bitter T，Kurz B，et al.Matrix-associated autologous chondrocyte transplantation/implantation(MACT/MACI)—5-year follow-up［J］.Knee，2006，13(3):194-202.

22 Bachmann G，Basad E，Lommel D，et al.MRI in the follow-up of matrix-supported autologous chondrocyte transplantation(MACI)and microfracture［J］.Radiologe，2004，44(8):773-782.(in German).

23 Ehlers EM，Behrens P，Wunsch L，et al.Effects of hyaluronic acid on themorphology and proliferation of human chondrocytes in primary cell culture［J］.Ann Anat，2001，183(1):13-17.

24 Grigolo B，LisignoliG，Piacentini A，etal.Evidence for redifferentiation of human chondrocytes grown on a hyaluronan-based biomaterial (HYAff 11):molecular，immunohistochemical and ultrastructural analysis［J］.Biomaterials，2002，23(4):1187-1195.

25 Grigolo B，Roseti L，Fiorini M，et al.Transplantation of chondrocytes seeded on a hyaluronan derivative(hyaff-11)into cartilage defects in rabbits［J］.Biomaterials，2001，22(17):2417-2424.

26 Brun P，Abatangelo G，Radice M，et al.Chondrocyte aggregation and reorganization into three-dimensional scaffolds［J］.JBiomed Mater Res，1999，46(3):337-346.

27 Pavesio A，Abatangelo G，Borrione A，etal.Hyaluronan-based scaffolds(Hyalograft C)in the treatment of knee cartilage defects:preliminary clinical findings［J］.Novartis Found Symp，2003，249:203-217;discussion 229-233，234-238，239-241.

28 Gobbi A，Kon E，Berruto M，et al.Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with second-generation autologous chondrocyte implantation:results at 5 years'follow-up［J］.Am J Sports Med，2009，37(6):1083-1092.

29 Nehrer S，Domayer S，Dorotka R，etal.Three-year clinical outcome after chondrocyte transplantation using a hyaluronan matrix for cartilage repair［J］.Eur JRadiol，2006，57(1):3-8.

30 Clar H，Pascher A，Kastner N，et al.Matrix-assisted autologous chondrocyte implantation into a 14 cm2cartilage defect，caused by steroid-induced osteonecrosis［J］.Knee，2010，17(3):255-257.

31 Kon E，Delcogliano M，Filardo G，etal.Second generation issues in cartilage repair［J］.SportsMed Arthrosc，2008，16(4):221-229.

32 Hendrickson DA，Nixon AJ，Grande DA，et al.Chondrocyte-fibrin matrix transplants for resurfacing extensive articular cartilage defects［J］.JOrthop Res，1994，12(4):485-497.

33 Ossendorf C，Kaps C，Kreuz PC，et al.Treatment of posttraumatic and focal osteoarthritic cartilage defects of the knee with autologous polymer-based three-dimensional chondrocyte grafts:2-year clinical results［J］.Arthritis Res Ther，2007，9:R41.

34 Kreuz PC，Muller S，Ossendorf C，etal.Treatment of focal degenerative cartilage defects with polymer-based autologous chondrocyte grafts:four-year clinical results［J］.Arthritis Res Ther，2009，11 (2):R33.

35 Niemeyer P，Pestka JM，Kreuz PC，et al.Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint［J］.Am JSports Med，2008，36(11):2091-2099.

36 Erggelet C，Kreuz PC，Mrosek EH，et al.Autologous chondrocyte implantation versus ACIusing3D-bioresorbable graft for the treatment of large full-thickness cartilage lesions of the knee［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2009，130(8):957-964.

37 Andereya S，Maus U，Gavenis K，et al.First clinical experiences with a novel3D-collagen gel(CaReS)for the treatmentof focal cartilage defects in the knee［J］.Z Orthop Ihre Grenzgeb，2006，144 (3):272-280.(in German).

38 Andereya S，Maus U，Gavenis K，et al.Treatment of patellofemoral cartilage defects utilizing a 3D collagen gel:two-year clinical results［J］.Z Orthop Unfall，2007，145(2):139-145.

39 Selmi TA，Verdonk P，Chambat P，et al.Autologous chondrocyte implantation in a novel alginate-agarose hydrogel:outcome at two years［J］.JBone Joint Surg Br，2008，90(5):597-604.

40 Ochs BG，Muller-Horvat C，Rolauffs B，et al.Treatment of osteochondritis dissecans of the knee:one-step procedure with bone grafting and matrix-supported autologous chondrocyte transplantation［J］.Z Orthop Unfall，2007，145(2):146-151.

41 Im GI，Jung NH，Tae SK.Chondrogenic differentiation ofmesenchymal stem cells isolated from patients in late adulthood:the optimal conditions of growth factors［J］.Tissue Eng，2006，12(3): 527-536.

42 Noth U，Osyczka AM，Tuli R，et al.Multilineagemesenchymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells［J］.J Orthop Res，2002，20(5):1060-1069.

43 Wakitani S，Goto T，Pineda SJ，et al.Mesenchymal cell-based repair of large，full-thickness defects of articular cartilage［J］.JBone Joint Surg Am，1994，76(4):579-592.

44 Wickham MQ，Erickson GR，Gimble JM，et al.Multipotent stromal cells derived from the infrapatellar fat pad of the knee［J］.Clin Orthop Relat Res，2003，(412):196-212.

45 Nathan S，Das De S，Thambyah A，et al.Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects:a novel use for adipose tissue［J］.Tissue Eng，2003，9(4):733-744.

46 Kuroda R，Usas A，Kubo S，et al.Cartilage repair using bonemorphogenetic protein 4 and muscle-derived stem cells［J］.Arthritis Rheum，2006，54(2):433-442.

47 Dragoo JL，SamimiB，Zhu M，etal.Tissue-engineered cartilage and bone using stem cells from human infrapatellar fat pads［J］.JBone Joint Surg Br，2003，85(5):740-747.

48 De Bari C，Dell'Accio F，Luyten FP.Failure of in vitro-differentiatedmesenchymal stem cells from the synovialmembrane to form ectopic stable cartilage in vivo［J］.Arthritis Rheum，2004，50(1): 142-150.

49 Bosnakovski D，Mizuno M，Kim G，et al.Chondrogenic differentiation of bovine bonemarrowmesenchymal stem cells(MSCs)in different hydrogels:influence of collagen typeⅡextracellular matrix on MSC chondrogenesis［J］.Biotechnol Bioeng，2006，93(6): 1152-1163.

50 Longobardi L，O'Rear L，Aakula S，et al.Effect of IGF-I in the chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells in the presence or absence of TGF-beta signaling［J］.JBone Miner Res，2006，21(4):626-636.

51 Wakitani S，Yamamoto T.Response of the donor and recipient cells in mesenchymal cell transplantation to cartilage defect［J］.Microsc Res Tech，2002，58(1):14-18.

52 Dominici M，Pritchard C，Garlits JE，et al.Hematopoietic cells and osteoblasts are derived from a common marrow progenitor after bone marrow transplantation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101 (32):11761-11766.

53 Lucarelli E，Beccheroni A，Donati D，et al.Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells［J］.Biomaterials，2003，24(18):3095-3100.

54 Mazzucco L，MediciD，SerraM，etal.The use of autologous platelet gel to treat difficult-to-heal wounds:a pilot study［J］.Transfusion，2004，44(7):1013-1018.

55 Giannini S，Buda R，Vannini F，et al.One-step bone marrow-derived cell transplantation in talar osteochondral lesions［J］.Clin Orthop Relat Res，2009，467(12):3307-3320.

56 Elisseeff J，McIntosh W，Fu K，et al.Controlled-release of IGF-I and TGF-beta1 in a photopolymerizing hydrogel for cartilage tissue engineering［J］.JOrthop Res，2001，19(6):1098-1104.

57 Saha K，Irwin EF，Kozhukh J，etal.Biomimetic interfacial interpenetrating polymer networks control neural stem cell behavior［J］.J Biomed Mater Res A，2007，81(1):240-249.

Cellular imp lantation and cartilage tissue engineering in articular cartilage defect repairing:the current status of clinicalapplication

LIN Zhen*，ZHENGQiu-jian，ZHENGMing-hao.*Division of Orthopedic，Department of Surgery，Guangdong General Hospital，Guangdong Academic of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China

ZHENGMing-hao，Email:minghao.zheng@uwa.edu.au

Cell based cartilage tissue engineering therapy is an advancing approach for the treatment of articular cartilage defect and one of the recent focuses in the field of orthopedic research.These techniques include chondrocyte implantation，cell-scaffold construct implantation，and stem cell therapy.The review introduced a number of tissue engineered cartilage techniques that have been conducted in the clinic worldwide，and summarized the outcomes of the clinical studies.

Cellular therapy; Cartilage repair; Tissue engineering; Chondrocyte

2010-01-14)

(本文編輯:沈敏 蔣婉潔)

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2010.02.011

廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(B2009004)

510080廣州，廣東省醫(yī)學科學院 廣東省人民醫(yī)院骨外科(林楨、鄭秋堅);浙江大學醫(yī)學院干細胞與組織工程實驗室(鄭銘豪)

鄭銘豪，Email:minghao.zheng@uwa.edu.au

本文文獻引用格式:林楨，鄭秋堅，鄭銘豪.細胞移植及軟骨組織工程技術在關節(jié)軟骨損傷臨床應用進展［J/CD］.中華移植雜志:電子版，2010，4(2):136-142.