灰樹花胞外多糖對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用

1 儀器與材料

1.1 樣品制備

灰樹花菌種經搖床培養得發酵液,之后經過醇沉,脫脂,脫蛋白,脫色,透析,冷凍干燥等一系列的處理得到 GFP。所制得的 GFP是白色粉末,易溶于水,且是含雜質較少糖蛋白綴合物。灰樹花胞外多糖是分子量范圍較大的多糖,分子量范圍大約在幾萬到幾十萬。根據苯酚-硫酸法檢測其中性糖含量為 58.08%±0.37%。

1.2 實驗動物

昆明種系實驗小白鼠,由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供,實驗動物許可證號: SCXK-(軍)2007-004。

1.3 主要試劑和儀器

丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒 (中生北控生物工程制品有限公司),丙二醛、過氧化氫酶等測定試劑盒 (南京建成生物工程制品有限公司)。

Ther mo酶標儀;LEI CA RM 2015組織切片機(浙江金華市科迪儀器設備有限公司);KD-H烘片機(浙江金華市科迪儀器設備有限公司);KD-P攤片機(浙江金華市科迪儀器設備有限公司);721可見紫外分光光度計(上海光譜儀器公司);Kendro冷凍離心機。

2 實驗方法

2.1 化學性肝損傷動物模型建立

肝損傷劑:用食用色拉油配制濃度為 0.2%的四氯化碳油溶液。

損傷方法:濃度為 0.2%的 CCL4油溶液腹腔注射劑量[3]為 10 mL/kg,即 0.2 mL/20 g,腹腔注射(ip)一次。

2.2 實驗方法

健康昆明小鼠常規飼養,稱重后隨機分為生理鹽水對照組 (control)、CCL4模型組、GFP高劑量組(300 mg/kg體重)、GFP中劑量組 (200 mg/kg體重)、GFP低劑量組 (100 mg/kg體重)、聯苯雙酯陽性組 (150 mg/kg體重),每組 8只。對照組以生理鹽水 0.1 mL/10 g灌胃,連續灌胃給藥 15 d,末次給藥 2 h后,用 0.2%CCL4色拉油 ip進行損傷,禁食24 h,斷頭取血。3500 r/min離心 8 min得血清,測血清丙氨酸氨基轉移酶,天門冬氨酸氨基轉移酶和過氧化氫酶活力,取肝臟 1500 mg按 1∶9比例加入預冷生理鹽水在冰浴中勻漿,測定丙二醛含量和乳酸脫氫酶活力。

2.3 生化指標測定方法

2.3.1 血清丙氨酸氨基轉移酶 (ALT):連續監測法。丙氨酸氨基轉移酶作用于由 L-丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及 L-谷氨酸,丙酮酸與NADH作用,生成L-乳酸和NAD+,340 nm處比色。

2.3.2 血清天門冬氨酸氨基轉移酶 (AST):連續監測法。天門冬氨酸氨基轉移酶作用于由 L-天門冬氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成 L-谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸與NADH作用生成L-蘋果酸和NAD+,340 nm處比色。

2.3.3 過氧化氫酶(CAT):過氧化氫酶(CAT)分解H2O2的反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止,剩下的H2O2與鉬酸銨作用產生一種淡黃色的絡合物,在405 nm處測定其生成量,可計算出 CAT的活力。

2.3.4 肝勻漿丙二醛:比色法。過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)與硫代巴比妥酸(T BA)縮合,形成紅色產物,532 nm處比色。(5)乳酸脫氫酶(LDH):乳酸脫氫酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中呈棕紅色,通過比色可求出酶活力。

2.4 數據統計處理

實驗數據以x±sd表示,組間比較用t檢驗,P＜ 0.05表示差異有顯著性,P＜ 0.01表示差異有極顯著性。

3 實驗結果

3.1 GFP對小鼠血清ALT和AST的影響

由表 1知,CCL4肝損傷模型組小鼠血清 ALT和AST明顯高于對照組,肝損傷模型成立。GFP3個劑量對因肝損傷引起的ALT,AST升高具有顯著的抑制作用,并且基本呈劑量效應。

表 1 GFP對肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響Table 1 Effect of GFP on serum ALT and AST in mice of liver Injury

3.2 GFP對小鼠血清過氧化氫酶(CAT)的影響

由表 2知,CCL4肝損傷模型組小鼠血清 CAT明顯低于對照組,肝損傷模型成立。GFP 3個劑量對因肝損傷引起的 CAT降低具有顯著的提高作用,并且基本呈劑量效應。

3.3 GFP對小鼠肝勻漿中丙二醛(MDA)的影響

由表 3知,小鼠肝損傷后,其肝臟中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)的含量顯著提高,預先給予GFP,可降低 CCL4肝損傷后引起的脂質過氧化作用,抑制了MDA的升高,并且基本呈劑量效應。

表 3 GFP對肝損傷小鼠肝勻漿中丙二醛(MDA)的影響Table 3 Effect of GFP onMDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.4 GFP對小鼠肝勻漿中乳酸脫氫酶(LDH)的影響

由表 4知,小鼠肝損傷后,其肝臟中乳酸脫氫酶活力顯著提高,預先給予 GFP,可降低 CCL4肝損傷后引起的脂質過氧化作用,抑制了乳酸脫氫酶活力的升高,并且基本呈劑量效應。

表 4 GFP對肝損傷小鼠肝勻漿中乳酸脫氫酶(LDH)的影響Table 4 Effect of GFP on LDH of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.5 小鼠肝臟組織的病理變化

正常對照組小鼠肝細胞結構組織正常,肝細胞以中央靜脈為中心呈細胞索排列整齊,細胞核分布均勻,呈球形;肝損傷模型組小鼠肝組織損傷嚴重,肝細胞排列紊亂,中央靜脈區有大量炎細胞浸潤現象,多數肝細胞呈細胞水腫,氣球樣變[4]可見明顯的點狀、灶狀壞死;GFP劑量組細胞排列較為整齊,中央靜脈區很少的炎細胞浸潤現象,肝小葉較為清晰,基本呈現細胞索排列,很少看到壞死病灶,有少許變性。

圖 1 GFP對 CCL4所致小鼠急性肝損傷組織病理學影響(HE,×40)Fig.1 Effect of GFP on histopathology ofmice with acute hepatic injury induced by CCL4(HE,×40)

4 討論

GFP能降低 CCL4升高的血清 ALT和 AST水平,顯著減輕肝細胞變性壞死與炎細胞浸潤,提示GFP具有抑制炎癥反應和肝臟保護作用。GFP低、中、高劑量組的抗 CCL4肝損傷的作用相比較而言,雖然高劑量組的效果比中劑量組高出的部分不是很明顯,但也可以說明本試驗基本呈現劑量效應,如果從用藥量和經濟效益上考慮,中劑量也能發揮較好的作用。CCL4造成的肝損傷是典型的自由基損傷,可顯著降低CAT酶活性,升高MDA、LDH酶活力水平。同時,激活 Kupffer細胞及中性粒細胞,影響肝細胞的DNA合成和分裂,引起急性肝損傷[5]。

GFP能顯著升高 CAT酶活性,降低MDA、LDH酶活力水平,提示 GFP對肝損傷的保護作用與其清除自由基、提高抗氧化酶活性有關。

總之,本研究表明 GFP對 CCL4誘導的化學性急性肝損傷動物模型具有明顯的保護作用。據報告[6]CCL4進入人體經肝細胞色素 P-450的代謝激活后。生成三氯甲基(·CCL3)自由基,迅速引起生物膜脂質的過氧化,從而破壞了生物膜結構和正常生理功能,導致細胞內ALT和 AST外溢,使血清中ALT與AST活性升高[7]乃至肝細胞壞死,也有人認為 CCL4經代謝激活后生成的自由基與細胞膜的大分子物質進行不可逆結合,破壞了肝細胞結構和功能。初步的研究發現,其機制可能與清除自由基、提高抗氧化酶活性等作用有關,進一步深入研究灰樹花多糖的抗肝損傷作用可望將其開發為新的治療肝病藥物。

致謝:本文在實驗的設計、操作及文章的撰寫過程中,得到了天津科技大學營養與衛生研究室曹小紅老師,王春玲老師,魯梅芳老師,曾斌老師和侯麗華老師的大力支持,在此誠摯的謝謝他們!

1 Bian DP(卞冬萍),Yang ZQ(楊振泉),Fang WM(方維明).Advance in the study on characteristics of extracellular polysaccharide fromGrifola frondosa.M od Food Sci Tech(現代食品科技),2005,12:247-250.

2 ZhengM(鄭敏),Xu AQ(徐愛芹),Bao CY(鮑翠玉),et al.Compared protective effect of angelica sinensis polysaccharide and allitridi on carbon tetrachloride induced liver injury in mice.W orld Chinese J D ig(世界華人消化雜志), 2003,11:348-349.

3 WangQZ(汪求真),Ma AG(馬愛國),Sun YY(孫永葉),et al.Effects of high dose vitamine on antioxidative function and DNA damage in rats.Acta Nutrimenta Sinica(營養學報),2005,27:467-470.

4 Xiao G(肖剛),WangQ(王勤).Protect ive effectofmogrosides on exper imental liver injury in mice.2.China Phar m(中國藥房),2008,3:163-165.

5 PalmesD,Spiegel HU.Animalmodels of liver regeneration.B iom aterials,2004,25:1601-1611.

6 Yang JX(楊建雄),Yuan JF(原江峰),Li FR(李發榮). The anti-oxidative effectof persimmon leaf flavonoidin vitro. Acta Nutrimenta Sinica(營養學報),2003,25:215-217.

7 Lee TY,Ma iL M,Wang GJ,et al.Protective mechanism of

salvia miltio rrhiza on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats.J P har m acol Sci,2003,91:202-210.

Protective Effect of Exo-polysaccharides Produced byGrifola frondosaon Carbon Tetrachloride Induced L iver Injury in M ice

CAO Xiao-hong,ZHU Hui,WANG Chun-ling,LU Mei-fang,ZENG bin＊,WANGAi-hua
Tianjin University of Science&Technology,College of Food Engineering and B iotechnology Tianjin key Laboratory of food Nutrition and Safety,Tianjing 300457,China

Acute hepatic injurymodelwas induced by CCl4in mice to study the protective effect of exo-polysaccharides produced by Grifola frondosa(GFP)on experimental liver injury in mice.The activities of alanine aminotransfe(ALT), aspartate aminotransferase(AST),catalase(CAT)in serum,lactate dehydrogenase(LDH),and the content of maleic dialdehyde(MDA)in the liver tissue were investigated,and the histological changes of liver were observed.GFP could decrease the serum activities ofALT,AST,and the activity ofLDH,MDA content in liver tissue,but increase the serum activities of CAT ofmice with acute hepatic injury induced by CCl4,and it could lessen the histological changesof liver. Consequently,we can see clearly that GFP showed protective effect on mice with acute hepatic injury.

Grifola frondosa;exo-polysaccharides;carbon tetrachloride;acute hepatic injury

Q485

1001-6880(2010)05-0777-04

2009-06-22 接受日期:2009-11-11

＊通訊作者 Tel:86-22-60601428;E-mail:zengbin@gmail.com