甲磺酸伊馬替尼對游離二氧化硅粉塵激活大鼠肺成纖維細胞效應的影響

邵苗苗,王 威,姚 武,張光輝,郝長付

鄭州大學公共衛生學院勞動衛生與職業病學教研室鄭州 450001

甲磺酸伊馬替尼對游離二氧化硅粉塵激活大鼠肺成纖維細胞效應的影響

邵苗苗,王 威,姚 武#,張光輝,郝長付

鄭州大學公共衛生學院勞動衛生與職業病學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1962年 8月生,教授,研究方向:職業性肺部疾患,E-mail:yaowu@zzu.edu.cn

甲磺酸伊馬替尼;二氧化硅;肺成纖維細胞;Ⅰ型膠原;Ⅲ型膠原;大鼠

目的:觀察甲磺酸伊馬替尼 ( IM)對游離二氧化硅 (SiO2)粉塵刺激所致大鼠肺成纖維細胞 (LF)激活過程的影響。方法:以游離 SiO2粉塵工作液對大鼠肺泡巨噬細胞 (AM)染毒 24 h,離心收集其培養上清。陽性對照組用該培養上清刺激大鼠 LF,3個實驗組在培養上清中分別加入終濃度為 0.2、1.0和 5.0μmol/L的 IM后處理大鼠 LF,陰性對照用未經 S iO2刺激的AM上清培養 LF;24 h后,收集各組培養上清,使用MTT法檢測LF細胞存活情況,用 RT-PCR方法檢測 LFα-平滑肌肌動蛋白 (α-S MA)、Ⅰ型膠原 (COLⅠ)及Ⅲ型膠原 (COLⅢ)mRNA的表達水平,用 EL ISA法測定培養上清中的 COLⅠ和 COLⅢ蛋白,用 BradFord法測定培養上清中的總蛋白。結果:5組存活細胞比例、α-S MA mRNA、COLⅠmRNA及蛋白、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達水平差異均有統計學意義 (F=3.571、3.904、18.686、6.582、28.983、8.555和 9.918,P均 <0.05)。與陰性對照組比較 ,陽性對照組上述指標均增高 (P均 <0.05)。與陽性對照組比較,各實驗組上述指標均降低,且隨 IM濃度的升高而降低 (P均 <0.05)。結論: IM可抑制游離 SiO2粉塵誘導大鼠LF的激活。

游離二氧化硅 (SiO2)粉塵作用于肺泡巨噬細胞(alveolusmacrophage,AM)將直接或間接導致后者分泌大量炎性細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉 化 生 長因 子 -β (transforming growth factor,TGF-β)等 ,這些因子可促使培養條件下的人肺成纖維細胞 (lung fibroblast,LF)增生,膠原蛋白生成增加[1]。甲磺酸伊馬替尼 (imatinib mesylate, IM)屬于血小板生長衍生因子酪氨酸受體抑制劑 (PDGF RTKI)的一種。有研究[2-3]表明IM能夠有效減緩放射引起的小鼠肺纖維化病程。作者用游離 SiO2粉塵刺激的大鼠 AM培養上清誘導LF,觀察誘導的 LF存活情況,α-平滑肌肌動蛋白 (αs mooth muscle actin,α-S MA)、Ⅰ型膠原 (collagenⅠ,COLⅠ)和Ⅲ型膠原 (collagenⅢ,COLⅢ)mRNA的表達情況,COLⅠ、COLⅢ蛋白及總蛋白的分泌,并觀察 IM應用后上述指標的變化,探討 IM對體外LF激活過程的影響,為進一步的體內研究提供依據。

1 材料與方法

以 GAPDH為內參,進行 PCR,引物序列及擴增產物大小見表1。PCR反應體系:Taq PCR Mix 15.0μL,10μmol/L上下游引物各 0.8μL,SYBR GreenⅠ0.7μL,cDNA模板 1.0μL,滅菌三蒸水 11.7μL。反應條件:預變性 95℃5min;變性 95℃30 s,退火54℃45 s(GAPDH)或退火 61℃45 s(α-S MA、COLⅠ和 COL Ⅲ),延伸 72℃1min,循環次數 40;終延伸 72 ℃5min。

1.1 材料 選用河南省實驗動物中心 SPF級成年SD大鼠,體質量 150 g。中國疾病預防控制中心勞動衛生研究所研制的結晶型 SiO2粉塵標準品,其中游離 SiO2含量為 99.8%,粒徑小于 5μm的占 95%以上。 IM購自武漢銀河醫藥有限公司,純度為99%。優級胎牛血清 (FBS)購自杭州四季青生物科技有限公司,DMEM培養基購自 Gibco公司。第一鏈 cDNA合成試劑盒購自天根生化科技有限公司。大鼠 COLⅢ酶聯免疫試劑盒購自上海前塵生物有限公司;大鼠 COLⅠ酶聯免疫試劑盒購自美國 R&D公司。SYBR GreenⅠ購自廈門百維信生物科技有限公司。

1.2 游離 S iO2粉塵工作液的配制 粉塵經研磨恒重干燥,干熱滅菌 (180℃1 h)后,用無血清的DMEM培養基配成 100 mg/L的游離 S iO2粉塵混懸液,漩渦振蕩器上振蕩混勻,4℃冰箱保存備用。

1.3 AM、LF的提取純化和 LF的同步化 取 SD大鼠,參照姜明等[4]的方法進行LF和AM的提取和純化。取第 5～10代 LF細胞進行試驗。取 LF,經胰酶消化后制成細胞懸液,隨機接種于培養瓶內,1×106個/60 cm2,以含體積分數 10%FBS-DMEM培養基培養 2 d后換液,用無 FBS培養基培養 24 h,使LF同步化。

1.4 實驗分組 用游離 SiO2粉塵工作液 (100 mg/L)對離體原代培養的 AM染毒 24 h,離心收集培養上清。陽性對照組用培養上清刺激同步化后的LF;實驗組在培養上清中加入 IM至終濃度為 0.2、1.0和 5.0μmol/L,刺激 LF;陰性對照組用未經 SiO2刺激的 AM上清培養LF。24 h后收集培養上清。

1.5 觀測指標

1.5.1 細胞存活情況 使用MTT法檢測上述 5組細胞存活情況,計算存活細胞比例。

1.5.2 α-S MA、COLⅠ和 COLⅢmRNA檢測 采用real time-PCR檢測。用 Trizol法提取 LF的總 RNA,紫外分光光度計測定 260 nm和 280 nm處的吸光度(A),A(260 nm)/A(280 nm)的值介于 1.8～2.0。

表1 擴增基因引物序列及產物大小

1.5.3 COLⅠ、COLⅢ及總蛋白測定 采用雙抗體夾心 ABC-酶聯免疫吸附法測定 COLⅠ、COLⅢ,按試劑盒說明書進行。采用 BradFord法測定培養上清中的總蛋白。

1.6 統計學處理 采用 SPSS 12.0進行數據分析。5組間 LF存活細胞比例,α-S MA、COLⅠ、COL ⅢmRNA及COLⅠ、COLⅢ和總蛋白表達水平的比較應用單因素方差分析及LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5組 LF存活細胞比例和α-SMA mRNA表達水平測定結果 見表2。

表2 5組 LF存活細胞比例和α-SMA mRNA表達水平的比較 (n=3)

2.2 COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白測定結果 見表3。

表3 5組間 COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達水平的比較 (n=3)

3 討論

矽肺是長期吸入含有結晶型游離 SiO2粉塵 (矽塵)所引起的以肺組織纖維性病變為主的全身性疾病。矽肺纖維化的發生,最關鍵的環節就是成纖維細胞的增殖與膠原的沉積。SiO2可刺激AM分泌大量細胞因子促使 LF活化和增殖,后者將分泌包括膠原蛋白在內的大量細胞外基質[5]。矽肺患者 AM培養上清可促進 LF的增殖,同時也促進膠原的合成與分泌[6]。因此抑制 LF的激活和增殖,降低其膠原蛋白分泌水平,將可以有效防治肺纖維化。

作者的研究結果顯示,陽性對照組 LF存活細胞比例及α-S MA mRNA表達水平,COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白和總蛋白表達水平顯著高于陰性對照組,這與 Vuorinen等[7]關于青石棉誘發進行性肺纖維化的研究結果類似;而實驗組隨著 IM濃度的升高,上述指標逐漸降低。α-S MA是 LF被激活的生物標識,α-S MA的表達受抑,提示 IM對 SiO2粉塵引起的LF的激活效應有一定的抑制作用。COLⅠ及COLⅢ和總蛋白分泌水平降低則表明, IM可抑制SiO2粉塵誘導的LF膠原的合成與分泌。

IM可能通過第二信使途徑[8-9]抑制 LF的蛋白分泌。Azuma等[10]報道 IM能夠顯著抑制至少三種激酶 ,Bcr/Abl,c-Kit和 PDGFR-α、-β,它們都參與纖維化的形成,尤其是與 TGF-β通路交聯。PDGF信號傳導通路在肺纖維化中起促進作用,并且通過抑制該通路治療纖維化疾病的療效已經在許多試驗[11-13]中被證實,如特發性肺纖維化、石棉致纖維化、博萊霉素致肺纖維化、放射致纖維化以及其他器官纖維化如腎、肝、皮膚和心臟等纖維化疾病。因此, IM可能通過 PDGF信號傳導通路發揮抑制 LF激活的作用。

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(2010-01-11收稿 責任編輯王 曼)

Effect of imatinib mesylate on rat lung fibroblast activation induced by free silica dustin vitro

SHAO M iaom iao,WANG W ei,YAO W u,ZHANG Guanghui,HAO Changfu
Departm ent of Occupational Health,College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

imatinib mesylate;silica;lung fibroblast;collagenⅠ;collagenⅢ;rat

A im:To evaluate the effect of imatinib mesylate( IM)on the activation process of rat lung fibroblast(LF)exposed to free silica(SiO2)dust.Methods:S iO2suspension was used to stimulate alveolusmacrophage for 24 h,and the supernatantwas collected to culture LF(positive control group).In the experimental groups,LF was stimulated by the collected supernatantwith 0.2,1.0,and 5.0μmol/L dose of IM.AM supernatantwithout SiO2was used as negative control.24 h later,the supernatants of all groupswere collected to detect the survival condition of actived LF byMTTmethod,the mRNA expression ofα-S MA,COLⅠ and COLⅢ,using real-time PCR,the COLⅠ and COLⅢprotein by EL ISA,and the total protein byBradFord assay.Results:There were significant differences in the survival condition of IF,the expressions ofα-S MA mRNA,COLⅠmRNA and protein,COLⅢmRNA and protein,and the total protein among the 5 groups(F=3.571,3.904,18.686,6.582,28.983,8.555 and 9.918,P<0.05).Compared with those of the negative control group,the indexeswere higher in positive control group(P<0.05).Comparedwith those of the positive control group,the indexes were lower in the experimental groups,which decreasedwith the IM concentration increase(P<0.05).Conclus ion: IM has the inhibition effect on LF activation stimulated by free SiO2.

R135.2