酶降解的枸杞多糖免疫增強作用實驗研究

潘志強

(江蘇省鎮江市第一人民醫院藥劑科，江蘇 鎮江 212002)

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是枸杞子經脫脂、水提、反復醇析所得，含量為4% ～10%，是一種水溶性大分子物質，具有免疫調節、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、護肝、防輻射、抗缺氧等功能，而諸多功能的發揮都源自于其對機體的免疫調節作用[1]。許多天然多糖是高分子化合物，無法通過機體屏障到達細胞而影響其生物學功能。對多糖進行降解，得到適宜相對分子質量的多糖片斷或寡糖，可以提高多糖的生物活性。師然新等[2]發現，相對分子質量是影響角叉菜多糖抗腫瘤作用的重要因素，適當減小可使抑瘤率升高，但太小又會使抑瘤率迅速降低，具有適中相對分子質量的角叉菜多糖能保持高的抑瘤率，即多糖被降解至一定相對分子質量范圍時能有效提高其抑瘤率。酶降解法可特異性、選擇性地切斷糖苷鍵。筆者研究了枸杞多糖經酶降解為中相對分子質量枸杞多糖后對小鼠的免疫系統的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品與試劑:酶降解得到的中相對分子質量枸杞多糖(經糖化酶降解，多糖含量高于81%，多角度激光光散射檢測器檢測2個極分的重均分子質量(Mw)分別為1 7110和1 6840，由湖北大學中藥生物技術省重點實驗室制備;RPMI－1640培養液(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、SDS、環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)均為 Sigma公司產品;噻唑藍(MTT，AMRESCO公司);印度墨水(北京篤信精細制劑廠)。ConA用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成100 μg/mL的溶液，避光保存備用。

動物:SPF級BALB/C小鼠160只，雌雄各半，體重18～22 g，由湖北省疾病預防控制中心實驗動物研究所提供，標準小鼠飼料由實驗動物研究所提供，實驗動物合格證號為SCXK(鄂)2003－0005。

儀器:恒溫水浴鍋(北京市長風儀器有限公司);TDL－5－A型離心機(上海安亭科學儀器廠);756PC型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);電子天平;Sigma低溫離心機;96孔板、酶標儀;全自動生化儀;記時秒表。

1.2 方法

1.2.1 免疫器官臟器指數測定

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，隨機分成4組，每組10只。低、中、高劑量給藥組分別給予酶降解的中相對分子質量枸杞多糖50，100，200 mg/(kg·d)，灌胃體積為 20 mL/kg，1 次 /d，連續 10 d;陰性對照組灌胃等體積生理鹽水(NS)。所有動物均食用全價營養配合飼料，自由攝食飲水。末次給藥12 h后，稱體重后處死，取出動物的脾臟、胸腺稱重，并計算臟器指數[3]。臟器指數(%)=臟器質量(g)÷動物體重(g)×100。

1.2.2 小鼠炭粒廓清試驗

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。連續給藥10 d后，按每10 g體重0.1 mL計算，于小鼠尾靜脈注射印度墨汁(將原液用生理鹽水稀釋5倍)，待墨汁注入后立即計時。分別于注射后2 min和10 min時從眼眶靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對照，于600 nm波長處測吸光度(A)值。將小鼠處死，取脾臟、肝臟，稱重。計算吞噬指數(K)及校正吞噬指數(a)，表示小鼠炭粒廓清的能力[4]。吞噬指數(K)=脾重)。K為直線斜率，可表示吞噬速率;a可反映每單位組織質量的吞噬活性。

1.2.3 小鼠脾淋巴細胞轉化試驗(改良MTT法)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。末次給藥4h后處死小鼠，以75%的酒精浸泡消毒，無菌條件解剖小鼠，取脾，剔除結締組織和脂肪并剪碎脾臟后，研碎，200目細胞篩網過濾，用Hanks液洗3次，懸液收集到無菌離心管，1 500 r/min轉速離心2 min，棄上清液，用Hanks液洗滌細胞2次，用RPMI－1640培養液將細胞稀釋成5×106個/mL，制成單細胞懸液。每只動物的脾細胞懸液分別加12個孔，1～4孔為對照孔，加入90 μL脾細胞懸液，10 μL RPMI－1640培養液(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，10%小牛血清);5～8孔為加ConA孔，加入90 μL 脾細胞懸液，50 μg/mL 的 ConA 液 10 μL;9～12 孔為加LPS 孔，加入 90 μL 脾細胞懸液，100 μg/mL 的 LPS 液 10 μL。置5%CO2，37 ℃ 培養，于培養第 68 h，各孔加入 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續培養4 h后，加入100 μL酸性二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩，于室溫放置15 min，用酶標儀于570 nm波長處測定吸光度 A值。T淋巴細胞的增殖能力=ConA孔的 A值－對照孔的 A值，B淋巴細胞的增殖能力=LPS孔的 A值－對照孔的 A值。

1.2.4 環磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。連續給藥10 d，第6天給藥2 h后腹腔注射環磷酰胺(按100 mg/kg體重計算，每天重復注射同樣劑量至第10天)，小鼠稱重。從小鼠眼眶取血0.5 mL，放入肝素處理的離心管中進行白細胞計數;另取胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數。

1.3 統計學處理方法

2 結果

結果見表1。

表1 酶降解的LBP對小鼠免疫器官臟器指數的影響(n=10，±s)

表1 酶降解的LBP對小鼠免疫器官臟器指數的影響(n=10，±s)

注:與陰性對照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

B淋巴細胞增殖影響試驗(A570)組別 劑量 臟器指數 炭粒廓清試驗 脾臟T淋巴細胞增殖影響試驗(A570)陰性對照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組等體積NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg胸腺指數0.211 ± 0.062 0.252 ± 0.031 0.294 ±0.039▲0.263 ±0.045△脾指數0.481 ±0.073 0.492 ± 0.064 0.515 ± 0.065△0.561±0.073△吞噬指數 K(min－1)0.015 66 ±0.003 5 0.019 7 ±0.006 7 0.125 9 ±0.024 3▲0.032 4 ±0.002 9▲校正吞噬指數 a 3.23 ± 0.76 3.52 ± 0.88 4.87 ±0.91△4.11 ±0.78△未加ConA孔0.288 ±0.040 0.311 ± 0.009 0.309 ± 0.014 0.305 ±0.007加ConA孔0.303 ± 0.056 0.352 ± 0.038 0.391 ±0.014△0.341 ±0.009 ConA差值0.015 ±0.007 0.041 ± 0.006 0.082 ±0.011△0.036 ±0.014未加LPS孔0.259 ±0.035 0.297 ± 0.067 0.302 ± 0.041 0.324 ±0.029加LPS孔0.283 ± 0.076 0.331 ± 0.074 0.387 ±0.091△0.401 ±0.078△LPS差值0.024 ±0.005 0.034 ± 0.006 0.085 ± 0.011△0.077±0.008△

表2 環磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(n=10，±s)

表2 環磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(n=10，±s)

注:與模型對照組比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

組別模型對照組正常對照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組藥物及劑量環磷酰胺組NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg白細胞數(106/mm3)3.66 ± 0.0712 9.46 ± 0.1132■5.42 ± 0.0872□6.57 ± 0.0896□5.58 ± 0.0749□胸腺指數0.091 ± 0.02 0.211 ± 0.36■0.152 ± 0.033□0.193 ± 0.035■0.164 ± 0.042□脾指數0.391 ± 0.101 0.585 ± 0.083■0.487 ± 0.054□0.575 ± 0.062■0.572 ± 0.071□

3 討論

脾臟中以B淋巴細胞為主調節體液免疫。巨噬細胞參與機體的特異性和非特異性免疫，具有強大的殺傷和清除作用，還能分泌細胞因子調節免疫，并將抗原提呈給T及B淋巴細胞[5]。多糖的生物活性與其相對分子質量、空間構象、硫酸根含量等有關。中相對分子質量多糖的活性大于高相對分子質量和低相對分子質量多糖;具有β螺旋型立體結構的多糖有較強的抗病毒活性。可通過化學法、酶法等降解高相對分子質量的多糖，以及采用硫酸化、乙酰化等方法修飾多糖以提高其生物學活性[5]。酶降解的枸杞多糖相對分子質量由30 000降到17 000左右。本研究表明:中相對分子質量的枸杞多糖可顯著增加小鼠脾臟指數;可顯著增強巨噬細胞的吞噬能力，提高機體對病原微生物的抵抗力;可顯著促進T及B淋巴細胞的增殖，從而增強機體的體液免疫和細胞免疫功能。另外，所有小鼠免疫試驗結果均無量效依賴關系，但酶降解的枸杞多糖中劑量組效果均較好，說明多糖類都有一個最適效應量，大于這個劑量反而效果下降甚至產生免疫抑制[6－8]。另外，中相對分子質量的枸杞多糖增強了機體的特異性和非特異性免疫功能，可以增加環磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指數、脾指數以及提高白細胞數目，是一種具有良好開發前景的免疫調節劑。對于酶降解的中相對分子質量枸杞多糖的分子空間構象、化學修飾與免疫作用的關系，尚需深入研究。

致謝:本實驗得到了湖北大學生命科學學院杜鵬副教授的熱忱幫助。

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