燙狗脊的質量標準研究

步顯坤， 許 枬， 袁 野， 單國順， 賈天柱

(遼寧中醫藥大學，遼寧大連116600)

中藥狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根莖。始載于《神農本草經》，為草部中品。具有補肝腎、強筋骨、舒經絡、除濕痛及利尿的功效，用于腰腿酸軟、下肢無力、風濕痹痛［1］。狗脊炮制方法歷史悠久，初見于《雷公炮炙論》:“細剉了，酒拌蒸”，現行2005年版中國藥典只收載砂燙法［2］。傳統炮制理論認為狗脊砂燙后其補肝腎作用增強［3］，與其他中藥配伍，在臨床中用于治療骨質疏松癥［4］、頸椎病［5］、神經脊髓炎［6］等老年性疾病。隨著社會人口的老齡化，老年性疾病日漸增多，狗脊的臨床用量也越來越多。2005版中國藥典狗脊炮制項下雖收載“燙狗脊”品種，但缺少質量控制標準，因此建立有效的方法用于燙狗脊質量的控制，保證臨床療效十分必要。目前有關燙狗脊質量控制研究鮮有報道。鑒于上述原因，本實驗采用TLC法對燙狗脊進行了定性鑒別研究，并采用HPLC測定了燙狗脊中原兒茶酸的含量，用于燙狗脊的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;KQ-250BB型數控超聲波清洗器超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA1004B萬分之一分析天平(上海精密科學儀器有限公司);sartorius-CP225D十萬分之一分析天平(上海精密科學儀器有限公司)。原兒茶醛對照品(供鑒別用，中國藥品生物制品檢定所，批號:0810-9402);原兒茶酸對照品(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號:110809-200503);薄層硅膠預制板(青島海洋化工品廠分廠、煙臺化學工業研究所、青島譜科分離器材有限公司);甲醇、乙腈均為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

試驗所用燙狗脊分別產于湖南、廣東、廣西、云南、福建、江西、四川等地，共12批;藥材經遼寧中醫藥大學王冰教授鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 色譜條件

硅膠G預制板(青島海洋化工品廠分廠、煙臺化學工業研究所、青島譜科分離器材有限公司);展開劑:三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8);顯色劑:1%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀溶液(1∶1);點樣量:對照品溶液2μL，供試品溶液3～6μL。

2.1.2 供試品和對照品溶液的制備

對照品溶液的制備精密稱取原兒茶醛和原兒茶酸對照品各2 mg，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備取燙狗脊2 g，加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜層析方法

精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液各3～6μL，點于同一硅膠G薄層板上，照薄層色譜法(中國藥典一部附錄VIB)操作，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵-鐵氰化鉀溶液，放置至斑點顯色清晰。薄層色譜結果見圖1。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Cromasil柱(250 mm×4.6 mm;5 μm);流動相:乙腈-1%醋酸水(5∶95);流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:260 nm;進樣量:10μL。理論塔板數按原兒茶酸計算，不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定原兒茶酸對照品加70%甲醇(1%醋酸配制)制成0.053 7 mg/m L的溶液，作為原兒茶酸對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

圖1 燙狗脊薄層鑒別色譜圖

取藥材粉末(過20目篩)1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，稱重，必要時補重，0.45μm微孔濾膜濾過，續濾液作為供試品溶液。

2.2.4 測定方法

精密吸取上述對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，測定色譜峰面積，計算原兒茶酸的含量。供試品溶液與對照品溶液的色譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 燙狗脊中原兒茶酸含量測定高效液相色譜圖

圖3 原兒茶酸對照品高效液相色譜圖(3.22的色譜峰為溶劑峰)

2.3 含量測定方法學考察

2.3.1 提取溶劑的選擇

經對回流提取的方法與超聲處理的提取方法比較，結果表明提取效率相當，因此提取方法選定較為簡單的超聲處理提取法;另外，不同溶劑的提取效率考察的結果顯示70%甲醇的冰醋酸水溶液提取率最高;70%甲醇的冰醋酸水溶液不同提取時間考察發現，超聲處理30 min提取效率最高。因此確定提取方法為:70%甲醇的冰醋酸水溶液超聲處理30 min。

2.3.2 流動相的選擇 通過對不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸為流動相考察色譜分離條件，結果顯示乙腈-1%冰醋酸系統色譜分離度最好，冰醋酸的用量對保留時間、分離度影響也較大。加入2%、1.5%、1.2%、1%冰醋酸后分離度的結果表明，乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)色譜分離度最佳，理論板數最高，因此確定乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)為流動相。

2.3.3 檢測波長的確定

測定原兒茶酸甲醇溶液的紫外吸收光譜，結果表明，最大吸收在260 nm，因此確定檢測波長為260 nm。

2.3.4 系統適用性實驗

采用Kromasil，Diamond，Agilent ZOBAX 3 種ODS 填料色譜柱(4.6 mm×250 mm)，對所建立的燙狗脊含量測定色譜系統進行考察，結果表明，原兒茶酸色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數大于3 000。

2.3.5 對照品的選擇

狗脊中含有大量的糖類和氨基酸類成分，但是目前沒有這類成分的單體化合物成分報道。而其酚酸類成分(狗脊中另一類主要成分［7］)中的原兒茶酸和原兒茶醛含量較高，其抗炎活性［8］與狗脊的藥理作用［9］相近。而且狗脊砂燙后原兒茶酸含量增高［9］，超過萬分之二，因此本實驗中采用原兒茶酸作為含量測定的對照品。

2.3.6 方法學考察

2.3.6.1 線性關系考察 分別吸取原兒茶酸對照品溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以原兒茶酸的進樣量為橫坐標，色譜峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程:Y=3 570.2X－48.345(r=0.999 4)。原兒茶酸進樣量在0.064 5～0.516μg范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.3.6.2 精密度試驗 分別精密吸取上述原兒茶酸對照品溶液10μL，連續進樣5次，按上述色譜條件測定色譜峰面積，RSD為1.64%，說明儀器精密度良好。

2.3.6.3 穩定性試驗 取湖南燙狗脊1 g(批號:080703)，精密稱定，按2.2.3項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8 h 注入高效液相色譜儀，測定原兒茶酸峰面積，計算其RSD為1.11%，表明供試品溶液在8 h內具有良好的穩定性。

2.3.6.4 重復性試驗 精密稱定湖南產燙狗脊5份(批號:080703)，按2.2.3項下方法分別制備成供試品溶液，按2.2.1項下含量測定方法測定原兒茶酸的峰面積，計算RSD為1.32%，說明該方法的重復性良好。

2.3.6.5 加樣回收率試驗 精密稱定湖南燙狗脊(批號080703)粉末0.5 g，共6份，分別加入原兒茶酸對照品溶液6、7.5、9.0 mL，按 2.2.3項下方法制備成供試品溶液，按2.2.1項下含量測定方法測定原兒茶酸含量，計算回收率。原兒茶酸的平均回收率為99.10%，RSD為2.47%，結果見表1。

2.3.6.6 樣品測定 分別取不同產地，不同批次的燙狗脊藥材粉末(過20目篩)1 g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備成供試品溶液，并按2.2.1項下色譜條件進行測定，計算含量。結果見表2。

表1 原兒茶酸回收率試驗測定結果

表2 12批燙狗脊原兒茶酸含量測定結果

3 討論

3.1 薄層鑒別對照品的選擇

狗脊化學成分研究表明，其主要含有為酚類、糖、蛋白質、揮發油等成分。但是糖類成分和蛋白質成分目前沒有可供定性鑒別使用的合適的對照品。而其酚類成分中以原兒茶醛和原兒茶酸的含量較高，而且二者的活性與狗脊的功效相近，這也是2005年版中國藥典狗脊定性鑒別項下采用原兒茶酸和原兒茶醛作為對照品的主要原因。鑒于狗脊砂燙后，原兒茶醛和原兒茶酸含量明顯增高，因此本實驗在建立燙狗脊的薄層定性鑒別時，采用原兒茶醛和原兒茶酸為對照品。

3.2 薄層色譜展開劑的選擇

經對多批藥材反復試驗，選定分離度較好的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)為展開劑。該展開劑對原兒茶酸和原兒茶醛分離好，而且毒性小。通過三個廠家硅膠G預制板的平行實驗，供試品色譜均有很好的分離度。

3.3 薄層鑒別顯色劑的確定

原兒茶酸和原兒茶醛均為酚性成分，與三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色靈敏。因此顯色劑確定為2%三氯化鐵-1%鐵氰化鉀(1∶1)溶液。由于該顯色劑長時間放置后，容易產生沉淀，因此最好預先分別配置2%三氯化鐵水溶液和1%鐵氰化鉀水溶液，臨用時現配制成1∶1的溶液。

本研究建立的燙狗脊的定性、定量檢測方法具有簡便快速、靈敏度高、重復性好、準確的特點，為燙狗脊的質量控制提供可靠的方法。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:155.

［2］賈天柱，李 軍，黃 非，等.狗脊炮制歷史沿革的研究［J］.遼寧中醫學院學報，2001，3(2):136.

［3］葉定江.中藥炮制學［M］.上海:上海科學技術出版社，2002:131.

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［5］賈存恩.頸安散治療頸椎病100例［J］.吉林中醫藥，1997，17(3):25.

［6］陰 健.中藥現代研究與臨床應用(3)［M］.北京:中醫古籍出版社，1997:182.

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［8］原 忠，余江天，蘇世文.用薄層掃描法測定中藥狗脊和黑狗脊中原兒茶酸及咖啡酸的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2000，17(5):338.

［9］鞠成國.中藥狗脊炮制原理研究［D］.大連:遼寧中醫學院，2002.