結核分支桿菌鏈霉素耐藥基因的雜交檢測

韓中波

鏈霉素(Sm)作為最主要的一線抗結核藥物之一,但由于單純化療和不規律化療,其耐藥情況日益嚴重,對其耐藥性的研究受到重視。[1]有報道認為結核分支桿菌耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白 S12編碼基因 rpsL和 16SrRNA的編碼基因 rrs的缺失和突變所導致[2]。本院采用采用 PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術檢測了 55株肺結核患者痰標本臨床分離株,并對 25例結核患者痰標本直接進行 rpsL基因、rrs基因突變檢測,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 23例敏感株和32例耐 SM或含耐SM的臨床分離株來自本所。25例耐 SM或含耐SM的肺結核患者痰標本來自本院住院結核患者。按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結核分支桿菌并對鏈霉素耐藥。

1.2 方法

1.2.1 細菌 DNA的制備[3]臨床分離株 DNA用常規酚/氯仿抽提法提取標本中 DNA。

1.2.2 PCR擴增 采用 25μl反應體系,4XdNTPs終濃度為0.2mmol/L,Bio-標記引物終濃度為 0.2μmol/L,擴增程序為:94℃變性 Imin,58℃退火 1min,72℃延伸 Imin,循環 30次,最后 72℃延伸 10min。擴增產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測出現 267bp條帶。

1.2.3 雜交檢測 將點有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中,加入雜交液放置水浴鍋中進行預雜交:45℃×30min。將Bio-標記引物的 PCR擴增陽性產物變性:95℃×l0min,取出迅速放入冰盒中,每毫升雜交液一般加 l0μl變性的擴增產物,放置水浴鍋中進行雜交:45℃ ×30min。洗膜:洗液 1、45℃ × 3min,洗液 2、45℃×3min。 SA-AP:用 1∶1000的稀釋液(洗液Ⅰ)與膜在 37℃作用 30min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃×3min,洗液Ⅱ、45℃×3min。顯色:每毫升洗液 I加入 NBT 6.6μl、BICP3.3μl混勻,將配好的顯色液加入雜交袋中,閉光 37℃顯色 5min,觀察結果。

2 結果

2.1 PCR擴增,以結核分支桿菌 H37RV為對照,23株藥物敏感株、32株耐 SM分離株 rpsL、rrs基因擴增均為陽性;25例耐 SM肺結核患者痰標本中 rpsL基因 18例擴增陽性、rrs基因 14例擴增陽性(見表 1)。

2.2 應用寡核苷酸探針反相斑點雜交技術檢測 rpsL、rrs基因突變結果(見表 1、2)。

表1

表2 對 55例臨床分離株的檢測結果(%)

23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為 4.3%、0。32株耐 SM分離株中,21株 rpsL基因發生突變,突變率為65.6%;4株 rrs基因發生突變,突變率為 12.5%。耐 SM肺結核患者痰標本中,基因突變檢測率分別為 50.0%、7.2%。

3 討論

迄今,檢測結核桿菌藥敏的傳統方法仍然是培養法,但由于結核桿菌生長緩慢,使藥敏測定結果需要兩個月,甚至更長時間,這也是影響結核病化療效果的原因之一。因此,建立一種新的快速,有效的藥敏試驗方法對結核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明[4]結核分支桿菌耐鏈霉素的產生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和 16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導致。本實驗室前期通過PCR-SSCP方法得出耐鏈霉素時,rpsL、rrs基因總突變率為 72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎上,難于標準化和質量控制,難以大規模推廣。通過對rpsL、rrs基因核心易變區進行DNA序列分析。根據基因突變的中心區域,設計靶基因,制備寡核苷酸探針,點樣在雜交膜上,進行PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交。

PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交檢測 rpsL、rrs基因突變,23株藥物敏感株的 rpsL、rrs基因突變率分別為 4.3%、0。32株耐 SM分離株中,21株 rpsL基因發生突變,突變率為65.6%;4株 rrs基因發生突變,突變率為 12.5%。由于有4.3%的敏感株也突變,說明某些耐藥菌株的形成可能與rpsL、rrs突變無關。

筆者用PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術直接檢測了 25例耐SM肺結核患者痰標本,rpsL基因 18例擴增陽性、rrs基因 18例擴增陽性,其基因突變檢測率分別為 50.0%、7.2%。低于耐 SM臨床分離株。這可能是由于痰標本雜質多,同時痰標本的處理和靶DNA濃度對 PCR擴增有直接影響。PCR-寡核苷酸探針反相斑點雜交技術以其簡便、快速、靈敏并可以直接檢測未經培養的痰標本中結核分支桿菌rpsL、rrs基因突變,為臨床檢測結核分支桿菌對鏈霉素耐藥性提供了初步依據。

[1] Marttuke GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampinresistant.mycobacterium trberoulosis by Sequencing and line probe assay.Scand JInfect Dis,1998,30(2):129-132.

[2] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mech anism ofmultiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium trberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.

[3] SmallScale Mycobacterial hromosomalDNA extraction.MRC,1995.

[4] 張小剛,李書琳,等.結核分支桿菌耐鏈霉素耐藥基因的檢測.實用醫學雜志,2001,17(10):1006-1007.