元蘑單孢雜交育種試驗研究1)

張躍新,閆寶松,馬鳳,毛憲偉

(1.黑龍江省林副特產研究所,黑龍江省非木質林產品研發重點實驗室,牡丹江 157011;2.牡丹江市林業局三道關林場)

元蘑學名亞側耳(Hohenbuehelia serotina),是黑龍江省特有的山珍之一。元蘑肉質細膩,柔嫩鮮美,營養價值極高,經常食用具有加強肌體免疫,增強機體抵抗能力,益智開心,益氣不饑,延年輕身等作用。近年來,我省元蘑栽培已初具規模,元蘑已成為我省食用菌的特色產品,產品除我省內銷外,在全國各地均有不同的市場需求。但不容忽視的是,我省元蘑產業還存在著菌種市場混亂、養菌后熟時間過長、平均產量不高等問題,為了解決這些問題,除了改善生產技術手段以外,更重要的一點就是改良品種,選育出產量高、后熟時間短的元蘑優良品種。本文通過單孢雜交育種試驗,選育出了元蘑優良品種,為元蘑產業的發展奠定了基礎。

1 元蘑菌株性狀調查與優良菌株收集

1.1 元蘑生產菌株調查與采集

我省元蘑主產區為牡丹江地區、伊春地區、尚志市,牡丹江地區尤以東京城林業局、大海林林業局元蘑產業較為突出。課題組在牡丹江地區東京城林業局、大海林林業局收集元蘑優良生產菌株各1個,編號為“元1” 、“元 2” 。

表1 元蘑主產區產量性狀調查表

1.2 野生元蘑品種的采集

課題組深入三道關林區進行了野生元蘑的采集,共采集野生元蘑品種2個,分別編號為“元3”、“元4”。其性狀見表2。

表2 野生元蘑性狀調查表

2 單孢雜交試驗

2.1 供試菌株

元 1,元 2,元 3,元 4(見表 1 、表 2)。

2.2 供試培養基

孢子萌發培養基:馬鈴薯 20g、葡萄糖 20g、瓊脂20g、硫酸鎂 1.5g、磷酸二氫鉀 3g、蛋白胨 5g,水1000mL;

PDA綜合培養基:馬鈴薯20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、硫酸鎂1.5g、磷酸二氫鉀3g,水1000mL。

2.3 水分對孢子萌發的影響試驗

將孢子分為兩組,分別用無菌水稀釋,并用血球計數板計算孢子數量。第一組稀釋后直接涂布在培養皿上,每個培養皿涂布100個孢子,三次重復,暗光25℃培養;第二組在 25℃條件下分別浸泡 0、8、16、24、32、40、48 、56、64 、72、80 h,浸泡后分別涂布于培養皿上,每個培養皿涂布100個孢子,三次重復,暗光25℃條件下培養,計算孢子萌發數。

2.4 單核體菌株的獲得

將孢子用連續稀釋法稀釋,涂布于培養皿上,經暗光25℃條件下培養,經鏡檢觀察,無鎖狀聯合即為單孢菌絲。

2.5 單核體配對雜交

將兩個不同親本的單核菌絲同時接種于平板培養基上,相距1.0～1.5cm,培養12d左右,待兩菌絲接觸后,挑取交界處的部分菌絲進行鏡檢,如發現鎖狀聯合,立即將其轉接于新的斜面培養基上。

2.6 營養親和性試驗

在斜面培養基的中間接種單孢雜交菌絲體,兩端分別接種親本的菌絲體,菌絲能互相長進去,連成一片的說明是同種菌絲,若在相交處形成明顯的黃褐色拮抗線,便說明菌種性質不同。只有在斜面上同時出現兩條拮抗線,才說明雜交成功,產生了新的性狀。

2.7 初篩試驗

將元1、元2、元3、元13、元23進行3級種的制作,各做50袋菌種,進行初步篩選。

2.8 復篩試驗

將初篩出的元13、元23雜交菌株進行袋栽復篩,連同CK(元1、元 2、元3)各栽300袋。對比平均產量及菌種成熟時間,最終篩選出元蘑優良新品種。

3 結果與分析

3.1 水分對孢子萌發的影響試驗

圖1 水分對孢子萌發的影響

由圖1可知,孢子不經浸水處理在40h以后才有少量萌發,在72h后才大量萌發;孢子經浸水處理后,在16h后就有少量萌發,在40h后大量萌發,但超過40h后,孢子的萌發數反而下降。因此,元蘑孢子經無菌水浸泡40h后萌發率最高。

3.2 單核體菌株的獲得

挑取單孢萌發菌絲進行培養,經單核體菌株菌絲體長勢觀察,篩選出菌絲體生長速度快,長勢旺盛的單核體菌株作為配對雜交所用的親本菌株。最終篩選出16個單核體用于雜交配對。

3.3 單核體配對雜交

雜交組合分別為元1×元2共24個組合,元1×元3共24個組合、元1×元4共24個組合、元2×元3共24個組合、元2×元24共4個組合、元3×元4共24個組合,合計雜交組合144個。

3.4 拮抗線檢測

在雜交的144個組合中共有91個組合產生拮抗線,元1與元2親緣關系較遠,元1與元3親緣關系較近,元1與元4親緣關系較遠,元2與元3親緣關系較近,元2與元4親緣關系較遠,元3與元4親緣關系較遠。

3.5 鏡檢鎖狀聯合標記

對未形成拮抗線的53個組合鏡檢有無鎖狀聯合,即說明通過雜交形成了具有鎖狀聯合的雙核菌絲體,表明雜交親和,共有2個組合,認為是雜交菌株。

3.6 營養親和性鑒定

這2個雜交菌株中與雙親均存在明顯拮抗現象,接觸處形成埂狀的拮抗線。說明這2個菌株與雙親均形成拮抗線的雜交菌株的遺傳物質發生了一定的變異,在生長代謝方面可能產生了某些與親本菌株相互有抑制作用的物質。拮抗現象表明這些雜交菌株是與雙親不同的菌株。

經初步雜交試驗,獲得雜交品種2個,即元1×元3組合、元2×元3組合的雜交種各1個,分別編號為元 13、元 23。(見表3)

表3 元蘑雜交結果

3.7 初篩試驗

經初篩試驗,篩選出養菌期后熟時間短、菌絲長勢好、菇型較好、產量較高的的雜交菌株元13、元23各2株。

3.8 復篩試驗

3.8.1 雜交菌株復篩產量分析

表4 雜交菌株復篩產量分析

雜交菌株復篩產量分析表明,元23、元13產量顯著高于其親本菌株(CK),元23與元13在產量上無顯著差異。

3.8.2 元蘑復篩菌絲體成熟時間顯著性分析

表5 元蘑復篩菌絲體成熟時間顯著性分析

由表5可知,元13在菌絲體成熟時間上與其親本有顯著差異,元23菌絲體成熟時間較短,但與其親本無顯著差異。因此,元13在菌絲體成熟時間上明顯優于其它菌株。

4 結論與討論

4.1 復篩試驗表明,在產量方面,雜交品種元 13、元23的產量均比其親本產量顯著提高,產量性狀較好;在菌絲體成熟時間上,元13菌絲體成熟時間短,顯著優于其它菌株,但元23與其親本無顯著差異。綜合比較,元13的性狀優于元23,因此,選定元13為元蘑雜交優良品種。

4.2 食用菌雜交育種是食用菌品種選育中應用最廣泛、收效最顯著的育種手段,尤其是單孢雜交育種,能獲得菌種更純的雜交品種。但嚴格意義上來講,單孢雜交育種并沒有經過核融合后分子水平上的基因重組,只是一種細胞水平上的物質重組。理論上,雜交后F2代菌株再經過單孢雜交就有可能得到核融合菌株,其優良性狀可能更多。因此,建議以后做F2代單孢雜交育種試驗。

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