復生康膠囊微生物限度檢查法方法驗證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗所,廣西南寧 530001）

復生康膠囊微生物限度檢查法方法驗證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗所,廣西南寧 530001）

目的建立復生康膠囊微生物限度檢查方法。方法 以3株細菌、2株真菌對復生康膠囊進行微生物限度檢查方法的驗證試驗。結果采用常規法大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%,枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿）的回收率達到70%以上,控制菌采用常規法進行檢驗,可檢出大腸埃希菌。結論經驗證復生康膠囊微生物限度檢查法應采用培養基稀釋法檢查細菌;常規法檢查霉菌、酵母菌和控制菌。

復生康膠囊;微生物限度;方法驗證;回收率;培養基稀釋法;常規法

復生康膠囊主要成分為蒲葵子、喜樹果、莪術、柴胡、絞股藍、香菇、黃芪、甘草、磷酸氫鈣[1-3]。具有活血化瘀、健脾消積功效,用于胃癌、肝癌的治療,能增強放療、化療的療效,增強機體免疫功能,改善臨床癥狀。處方中的莪術、柴胡有一定的抑菌作用[4-5]。根據其用藥途徑、成分和制法,按照2005年版《中國藥典》一部附錄XⅢC微生物限度檢查法[6],應進行細菌數、霉菌和酵母菌數測定,及控制菌大腸埃希菌檢查,建立微生物限度檢查方法,并加以驗證。

1 儀器與試藥

1.1 實驗菌種 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、大腸埃希菌 CMCC（B）44102、白色念珠菌 CMCC（F）98001、黑曲霉 CMCC（F）98003,均由廣西食品藥品檢驗所提供。

1.2 樣品 復生康膠囊:批號:051101、060101、060102;由廣西昌弘制藥有限公司生產。

1.3 培養基及稀釋劑 營養瓊脂培養基,玫瑰紅鈉瓊脂培養基,營養肉湯培養基,膽鹽乳糖培養基（BL）,膽鹽乳糖發酵培養基,乳糖發酵培養基,改良馬丁培養基,改良馬丁瓊脂培養基,MUG培養基,曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB）,由廣西食品藥品檢驗所提供,按干燥培養基瓶簽方法配制;pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,0.9%無菌氯化鈉溶液按《中國藥典》2005年版二部附錄方法配制。

2 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法的建立及驗證

2.1 菌液制備 取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經25℃培養24～48h的白色念珠菌液體培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物,加10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用。

2.2 供試液的制備方法 取樣品10 g,加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL,制備成溶解均勻的1∶10的供試液。

常規法:取供試液1 mL注皿。

培養基稀釋法:取供試液1 mL注入2個平皿中（0.5 mL/皿）。

2.3 回收率試驗 試驗組:取規定量供試液及50～100 CFU各試驗菌,分別注入同一平皿中,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度,平行制備2個平皿。細菌培養24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養48～72 h。

菌液組:取50～100 CFU各試驗菌注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度,細菌培養24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養48～72 h,測定所加入的試驗菌數,平行制備2個平皿。

供試品對照組:取規定量供試液,立即傾注瓊脂培養基,待凝固后,置規定溫度,細菌培養24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養48～72 h,測定供試品本底菌數。

2.4 方法的確定

2.4.1 常規法 見表1。

表1 復生康膠囊常規法試驗結果 CFU/皿

從表1表明,常規法對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%,可采用常規法對復生康膠囊霉菌及酵母菌數計數。枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率均低于70%,表明該法進行細菌計數不可行。

2.4.2 培養基稀釋法 見表2。

表2 培養基稀釋法（0.5 mL/皿） CFU/皿

表2表明,采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿）,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率達到70%以上,故可采用該法進行細菌計數。

2.5 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法驗證 見表3。

表3 3批復生康膠囊回收率試驗結果 %

表3表明,采用培養基稀釋法（0.5mL/皿）,進行細菌微生物限度檢驗,3種試驗菌回收率均大于70%。霉菌及酵母菌計數方法為常規法,其2種規定試驗菌回收率均大于70%。方法可行。

3 控制菌檢驗方法的建立及驗證

試驗組:取1∶10供試液10 mL接種至100 mL膽鹽乳糖培養基,同時加入大腸埃希菌10～100 CFU,35℃培養24～48 h。取培養物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養基的試管中,35℃培養24 h,360 nm紫外燈下觀察熒光,然后進行靛基質試驗,觀察結果;另取培養物劃線接種于曙紅亞甲藍（EMB）平板,35℃培養18～24 h,觀察其菌落形態。

陰性菌對照組:取金黃色葡萄球菌作為陰性對照試驗菌,方法同試驗組。

經膽鹽乳糖培養基增菌培養后,試驗組與陰性對照組相比較有明顯的變化,試驗組有明顯產酸產氣現象,結果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規法試驗結果

表4表明,采用常規法進行大腸埃希菌檢驗,方法成立。

4 3批復生康膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的復生康膠囊微生物限度檢查法,對3批樣品進行檢驗,細菌、霉菌及酵母菌數均小于10個/g,未檢出大腸埃希菌。

5 討論

5.1 在對藥品進行微生物限度檢查方法的驗證時,采用預試驗方法對驗證用菌株抑菌活性的強弱進行預測,可為正式試驗的方法提供依據,同時可以減少工作量及試藥、試劑的浪費,提高工作效率。

5.2 由于藥品中的污染菌種類繁多,不同藥品對不同種類的細菌、霉菌的抑制作用強弱程度不同,不同藥品處方成分及其各成分的量不同等因素,對微生物的生長影響不一。復生康膠囊處方中的莪術、柴胡對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用,但抑菌活性強度不強,在常規法達不到藥典要求時,采用培養基稀釋法即可以使這兩種菌的試驗回收率達到70%以上。

5.3 經實驗驗證確定復生康膠囊微生物限度檢查方法可按以下進行,培養基稀釋法（0.5mL/皿）測定細菌數,常規法測霉菌及酵母菌數;采用常規法進行大腸埃希菌檢驗。

:

[1]高鵬,徐立春,陳平,等.莪術醇生物構建自體瘤苗治療晚期胃癌患者近期療效研究[J].吉林中醫藥.2008,28（1）:54-58.

[2]李鴻燕.小柴胡湯為主治療慢性萎縮性胃炎86例臨床觀察[J].吉林中醫藥,2006,26（1）:20.

[3]宗秀芝,于晶.黃芪治療心血管疾病的作用機理[J].吉林中醫藥,2008,28（8）:601.

[4]袁長津,盧芳國,朱應武.小柴胡湯及其加減方體外抗菌作用的實驗研究[J].中醫藥導報,2005,11（10）:54-55.

[5]魏玉平,駱志成.莪術揮發油體外抗念珠菌活性的研究[J].中國麻風皮膚病雜志,2005,21（7）:524-526.

[6]國家藥典委員會.中國藥典一部[S].2005:附錄XⅢC:70-77.

R282

A

1007-4813（2010）01-0131-02

顏棟林（1970-）,男,大學本科,主管藥師。研究方向:食品藥品標準研究。

（

2009-10-15）