耐酸乳酸菌的篩選及初步鑒定

茍興華,王艷文,李 翔,劉達玉,王 衛

(1.成都大學生物產業學院,四川成都 610106;2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

耐酸乳酸菌的篩選及初步鑒定

茍興華1,2,王艷文1,李 翔1,2,劉達玉1,2,王 衛2

(1.成都大學生物產業學院,四川成都 610106;2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

以自然發酵泡菜汁液為菌源,以不同的pH值作為對照,并利用不同的pH值作為篩選的初步條件,對耐酸乳酸菌進行篩選,然后對篩選出的菌株做定性實驗,包括：產生溶鈣圈,革蘭氏染色陽性,以及接觸酶反應呈陰性.在本實驗條件下初步篩選出耐酸性強的2株菌株：菌株2,菌株3,同時,對分離出的乳酸菌菌株劃線于MRS固體斜面培養基上,于4℃下保存,為進一步研究奠定了良好的基礎.

耐酸乳酸菌;篩選;初步鑒定

0 引 言

凡能從葡萄糖或乳糖的發酵過程中產生乳酸菌的細菌統稱為乳酸菌.大量的科研結果表明,以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌,其數量的多少,直接影響到人們的健康及壽命長短[1].研究表明,大部分乳酸菌在通過人體消化道到達腸道之前,因不能耐受胃液酸度而死亡,而僅有少數乳酸菌能耐酸,此類耐酸性乳酸菌能在人體中更有效地發揮保健作用,因此具有很大的開發價值[2,3].

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是人類和動物腸道內有益微生物之一,其可以阻止病原微生物對腸道的入侵和定植,抑制病原菌和抗感染,維持腸道的微生態平衡,預防和抑制腫瘤的發生,增強機體免疫力,促進消化,降低膽固醇,抑制內毒素的發生,延緩機體衰老和抗輻射等.嗜酸乳酸菌在腸道中的數量與宿主的健康狀況有著密切的關系,這已引起了人們的特別關注.嗜酸乳桿菌產生的具有抑菌活性的代謝產物細菌素,不僅可以改善腸道的微生態,而且是一類具有潛在開發價值的天然食品防腐劑和飼料添加劑.目前,耐酸乳酸菌已被廣泛應用于食品、醫藥以及工業等領域.本研究的主要目的是初步篩選出可以預期作為調節腸道菌群平衡的微生態制劑菌株,為今后的應用及研究打下基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 菌株來源.

以自然發酵泡菜作為篩選菌株的主要來源.

1.1.2 培養基.

MRS選擇培養基：蛋白胨 10 g、牛肉提取物10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、檸檬酸二胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g(固體培養基中加瓊脂約15 g、3%碳酸鈣)、蒸餾水1 000 m L,pH值為6.2～6.8.

1.1.3 試 劑.

實驗所用試劑包括：正丁醇,甲酸,乙酸,乳酸, 3%溴甲酚藍酒精溶液,3%過氧化氫等,均為分析純.

1.1.4 儀 器.

實驗所用儀器包括：手提式不銹鋼蒸汽消毒器, LRH系列生化培養箱,無菌操作臺,FA(N)/JA(N)系列電子天平.

1.2 實驗方法

1.2.1 耐酸乳酸菌的初步分離.

取自然發酵泡菜汁液1 mL以10倍遞增稀釋方法(1份泡菜汁,9份無菌水,再取1份第1支管中溶液,加9份無菌水,依次類推)將其稀釋,然后分別取第4～6支試管稀釋液1 mL,傾注于pH值為3.5和pH為3.0的MRS液體培養基上,放置于30℃恒溫培養箱中培養48 h.

1.2.2 耐酸乳酸菌初步分離后的純化.

用接種環以無菌操作方式挑取自然發酵泡菜稀釋液,將挑取有樣品的接種環在MRS固體培養基上做連續劃線,劃線完畢后,蓋上培養皿蓋,倒置于溫室中培養.

1.2.3 耐酸乳酸菌的進一步分離.

分別取第4～6支試管稀釋液1 mL,傾注于pH值為3.3的MRS液體培養基上,放置于30℃恒溫培養箱里培養48 h.

1.2.4 耐酸乳酸菌的進一步純化.

耐酸乳酸菌的進一步純化步驟按1.2.2項下步驟進行.

1.2.5 細胞染色及形態鑒定.

在菌落形態方面,觀察分離培養基平板上菌落的形態(形狀、色澤、大小等);在細胞形態方面,將所分離的菌株進行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體形態.

1.2.6 過氧化氫酶(接觸酶)反應.

將3%的過氧化氫滴于涂有菌苔的載玻片上,靜置1～3 min,觀察是否有氣泡產生.

1.2.7 產乳酸定性分析實驗.

本實驗采用乳酸紙層析法做產乳酸定性分析,具體方法如下：

(1)層析濾紙的制備.將層析濾紙剪成1.5 cm× 11 cm的長條狀,在距層析紙一端約4 cm處用鉛筆劃線確定點樣線,使用前充分干燥.

(2)配制展開劑.正丁醇∶甲酸∶水為80∶15∶5. (3)配制標準液.配制1.5%的乳酸溶液.

(4)制備待測樣品.將菌種37℃培養24 h后離心,收集上清液

(5)點樣.用毛細管分別吸取發酵液,多次點樣于濾紙條上,樣點直徑不宜超過2 mm,平衡2 h.

(6)層析.將點好樣的層析紙放入,使點有樣品的一端浸在展開劑中,但不可浸及樣點.觀察展開情況,待展開劑前沿到達離層析紙另一端約1.5 cm處,取出層析紙.

(7)顯色.以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑,待層析液揮發之后,向層析濾紙噴灑并計算 Rf值.

1.2.8 菌種保存.

目標菌株純化后,劃線于MRS固體斜面培養基上,于4℃下保存.

2 結果與分析

2.1 耐酸乳酸菌初步分離純化后結果

耐酸乳酸菌在pH值分別為3.5與3.0的液體MRS液體培養基上經初步分離后,在MRS固體培養基上劃線純化.在pH值為3.5的液體培養基中生長的菌株接種到固體培養基上時,形成溶鈣圈的菌落眾多,排列緊密,且長勢良好;在pH值為3.0的液體培養基上生長的菌株接種到固體培養基上時,無明顯菌落形成,更無產生溶鈣圈的菌落產生.

2.2 耐酸乳酸菌進一步分離純化后結果

在pH值為3.3的MRS液體培養基上分離的菌株接種到固體培養基上純化培養后,在固體培養基上形成的溶鈣圈明顯,約1～3 mm,圓形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黃色,形態良好的菌落若干個.即在介于pH值為3.5和3.0之間pH值為3.3的條件下,分離得到了相對耐酸性較強的菌株.

2.3 細胞染色與形態鑒定結果

隨機挑取3個菌落的細胞進行染色和形態鑒定：3個菌落的細胞均呈多樣形桿狀(長或細長桿狀,彎曲形短桿狀及棒形球桿狀),呈鏈狀排列.同時,革蘭氏染色呈陽性.

2.4 過氧化氫(接觸酶)反應實驗結果

將3%的過氧化氫滴于涂有菌苔的載玻片上,靜置1～3 min,菌落1有氣泡產生,菌落2和3無氣泡產生.

接觸酶又稱為過氧化氫酶,是一種以正鐵血紅素作為輔基的酶,能將過氧化氫分解為水和氧.一般好氧細菌與兼性厭氧細菌(除某些鏈球菌、乳酸桿菌等外)都能產生接觸酶,而厭氧細菌不產生接觸酶,不發生過氧化氫反應.本實驗結果表明：菌落1的細菌為好氧細菌或是兼性厭氧細菌;而菌落2和3的細菌為厭氧細菌.

2.5 產乳酸定性分析實驗結果

采用紙層析法測試乳酸噴顯色劑后顯色情況,實驗結果如圖1所示.

Rf1=19/25=0.76,Rf2=18.8/25=0.752,Rf3=18.9/25=0.756圖1 產乳酸定性分析結果

結果分析顯示：噴顯色劑后菌落2和3都出現黃色斑點,與2%乳酸對照相比,位置基本相同,證明有乳酸的存在,表明2種菌都產乳酸.

3 結 論

本文以自然發酵泡菜汁液為菌源,以pH值作為對照,首先利用不同的pH值作為篩選的初步條件,進行了耐酸乳酸菌的篩選,然后對篩選出的菌株做定性實驗,包括產生溶鈣圈,革蘭氏染色陽性,以及接觸酶反應呈陰性,從而初步篩選出在本實驗條件下耐酸性強的2株菌株：菌株2,菌株3,分離出的乳酸菌菌株已經劃線于MRS固體斜面培養基上,于4℃下保存.

在下一步的研究中,我們擬進一步進行乳酸菌的定性分析實驗,同時對其16s RNA進行測序分析.需要說明的是,如何在發酵以及其他領域應用好這些菌株來強化發酵食品以及其他制品的保健功能性,提高農副產品的附加值是今后科研工作的重點和難點.

[1]張大為,張 潔,丁成華.嬰兒腸道內嗜酸乳桿菌L2的篩

選及菌株代謝產物的初步分析[J].食品科學,2008,29 (4)：221-226.

[2]馬德功,王成忠,崔文文,等.發酵香腸乳酸菌發酵劑篩選標準[J].肉類研究,2007,21(12)：36-38.

[3]陳 霞,烏日娜,孟 和,等.乳酸菌耐酸機理[J].中國乳品工業,2008,36(3)：31-35.

[4]管立軍,李艷芳,程永強,等.產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及分離鑒定[J].食品科技,2009,34(1)：10-13.

[5]王玉華,張桂榮,劉景圣.2株耐酸及耐膽鹽嗜酸乳桿菌的分離篩選及其發酵特性研究[J].東北師大學報(自然科學版),2006,38(3)：121-124.

[6]潘繼紅,呂正兵,夏 穎,等.酸乳中乳酸細菌的分離及酸乳制作工藝的探討[J].安徽師范大學學報(自然科學版),2000,23(1)：69-70.

[7]李海燕,徐 杰,云月英,等.傳統發酵酸馬奶中瑞士乳桿菌耐酸性的篩選[J].乳業科學與技術,2006,29(4)：9-11.

[8]胡書芳,王雁萍.乳酸菌在泡菜生產中的應用[J].安徽農業科學,2008,36(21)：275-277.

[9]陳 濤,曹 毅,伊芬芬,等.一株耐酸硫酸鹽還原菌的分離篩選及生理特性研究[J].四川大學學報(自然科學版),2006,43(2)：215-221.

[10]徐海燕,曹 斌,楊軍方.雞源嗜酸乳桿菌的篩選[J].中國飼料,2006,17(19)：35-37.

[11]陳 欣,潘素華,胡黎黎,等.人源乳酸桿菌耐酸耐膽鹽能力的測定和鑒定[J].現代預防醫學,2006,33(3)：28-29.

Preliminary Identification and Screening of Acid-resisting Lactic Acid Bacteria

GOU Xinghua1,2,WANG Yanwen1,LI Xiang1,2,LIU Dayu1,2,WANG Wei2

(1.School of Bioindustry,Chengdu University,Chengdu 610106,China; 2.Key Meat Processing Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610106,China)

Taking the natural fermentation of kimchi as germ origin,different PH values as comparing aspects as well as preliminary screening conditions,acid-resisting lactic acid bacteria was screened and the screened strains were used to do qualitative experiments,which consisted of generating circle of calcium dissolved,the results of Gram stain test and catalyzing reaction were positive and negative respectively.Finally,two acid-proof strains,namely Strain 2 and Strain 3 were obtained in this experiment.In order to do the following study,the two kinds of lactic acid bacteria have been crossed on MRS solid slope medium and preserved at the temperature of 4℃.

acid-proof lactic acid bacteria;screen;preliminary identification

Q935

：A

1004-5422(2010)02-0095-03

2009-12-15.

茍興華(1963—),男,博士,副教授,從事食品生物技術研究.

文章編號：1004-5422(2010)02-0120-04