轉cry3A基因馬鈴薯外源蛋白表達和對馬鈴薯甲蟲抗性分析

羅曉麗，楊 欣，郭文超，田穎川，付文君，吳家和

（1.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000；2.中國科學院微生物研究所，國家基因組學重點實驗室，北京100101；3.新疆農業科學院植物保護研究所，新疆烏魯木齊830000；4.新疆伊犁州農業技術推廣站，新疆伊犁835000）

馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）對馬鈴薯的為害極為嚴重，是世界上重要的毀滅性檢疫害蟲。馬鈴薯甲蟲分布面積廣，遍及亞洲、非洲、歐洲和北美洲的30多個國家和地區，其較強的遷飛擴散能力使馬鈴薯嚴重減產。各種物理、化學和生物防治方法應用于消滅馬鈴薯甲蟲的工作中，其中化學防治是最常見的防治方法。但是，馬鈴薯甲蟲對類似砷制劑、有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等殺蟲劑產生的抗性快速提高，以至于這些殺蟲劑起不到長期的殺蟲作用，并且有毒化學物質對人類健康也產生了不小的威脅。在這種情況下，轉抗蟲基因馬鈴薯的高效殺蟲能力得到大家的青睞。蘇云金芽孢桿菌制劑對馬鈴薯甲蟲低齡幼蟲殺蟲效果較好。Cry3A是從蘇云金芽孢桿菌一個亞種B t ssp tenebrionis中分離出來的毒性蛋白，其基因轉入馬鈴薯后產生的毒蛋白對馬鈴薯甲蟲有很好的毒殺功效。Perlak，Adang等[1-2]用合成的cry3A基因轉入馬鈴薯植株中，獲得了有效抗馬鈴薯甲蟲的轉基因植株。山西省農科院棉花所生物技術實驗室也把改造的cry3A基因導入到馬鈴薯品種紫花白中，獲得較好的抗蟲效果。

本研究對4個轉基因馬鈴薯株系外源毒蛋白的表達量及其對馬鈴薯甲蟲的抗性進行分析，并對高抗馬鈴薯甲蟲的轉基因株系C3-9的田間抗蟲性和產量進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料

供試品種：對照為新疆當地主栽品種紫花白，4個轉cry3A基因株系由山西省農科院棉花所生物技術實驗室培育，其轉化受體親本也為紫花白。

蟲卵取自新疆瑪納斯縣農業技術推廣站試驗地，將采集的二代馬鈴薯甲蟲卵，放置在濕潤的培養皿內孵化幼蟲。

1.2 ELISA檢測方法

每個材料取50 mg葉片，液氮研磨成粉狀，蛋白提取、包被和顯色參照Bt-Cry3A ELISA Complete Kit（PSA 05900/0288，Agdia，Inc）標準程序進行。用1 mL MEB研磨成勻漿，置于1.5 mL EP管離心，提取出總蛋白。在405 nm下，用酶標儀（BIO-RAD680）測量Cry3A的濃度。

1.3 離體葉片飼喂馬鈴薯甲蟲試驗和田間抗蟲性調查

馬鈴薯材料于2009年種植在新疆農業科學院植保所安寧渠試驗基地和伊犁特克斯縣農技站試驗地，4個轉基因株系和對照（CK1）按隨機區組排列設計，3個重復，不噴施任何農藥。附近種植的對照（CK2）噴施農藥防治馬鈴薯甲蟲。其他栽培措施均一致。

1.3.1 實驗室飼喂馬鈴薯甲蟲 試驗于2009年7月在新疆農業科學院植保所安寧渠試驗基地的實驗室內常溫下進行。將取自新疆瑪納斯縣農業技術推廣站試驗地的二代馬鈴薯甲蟲卵塊置于室溫保濕環境下，待其孵化，用毛筆輕挑取初孵幼蟲，置于直徑為10 cm的培養皿中，每個培養皿為1個處理，供試的活蟲數10頭。同時采集一定數量的4個轉基因株系和對照的幼嫩葉片，將這些葉片的葉柄用棉球或吸水紙包裹起來。每個處理的嫩葉置于相應編號的培養皿內，4齡幼蟲老熟后移至有沙土的塑料杯內飼養，每日更換新鮮葉片，對各齡期幼蟲在不同轉基因株系上的發育及死亡情況進行記載。

1.3.2 田間抗蟲性調查 在新疆伊犁特克斯縣農技站試驗地對轉基因馬鈴薯的抗性進行調查。發生動態調查采用定點定株調查方法，越冬代成蟲開始出現時，在每小區3點取樣，每點連續選取5株并掛牌。統計掛牌株馬鈴薯甲蟲卵、幼蟲和成蟲數量。之后每7 d調查1次，對不同轉基因株系上的馬鈴薯甲蟲的自然減退率、發育期及為害情況進行記載。根據馬鈴薯生長的不同時期分2次調查，最后統計馬鈴薯為害率。測產時各小區隨即選3點，每點連續5株，求出單株的平均產量。

2 結果與分析

2.1 轉基因馬鈴薯株系的Cry3A表達量分析

為了對不同轉基因株系的Cry3A表達量進行定量分析，試驗從田間采取幼嫩的葉片進行ELISA分析。結果表明，4個轉基因株系均有外源蛋白的表達，但表達量差異顯著，相對紫花白對照來說，4個轉基因的表達量變幅為1.4～9.0 μg/mg（圖 1）。其中，C3-9株系的表達量最高，C3-6株系的表達量最低。

2.2 轉基因馬鈴薯的抗蟲性分析和產量評價

2.2.1 轉基因馬鈴薯株系離體葉片飼喂馬鈴薯甲蟲分析 對4個轉基因株系和對照葉片的離體飼喂馬鈴薯甲蟲的試驗結果表明，抗蟲轉基因株系葉片對馬鈴薯甲蟲具有毒殺、滯育等作用（表1）。其中，C3-9株系在飼喂6 d后，馬鈴薯甲蟲全部死亡，而其他3個株系雖然有一定的毒殺效果，但還不能達到大面積應用的效果。究其原因，可能是C3-9表達的外源蛋白量遠高于其他3個株系，其葉片含毒蛋白水平達到完全毒殺馬鈴薯甲蟲的劑量。從表1還可看出，其他3個轉基因株系在馬鈴薯甲蟲不同齡期的致死率均顯著高于對照，同時對幸存的馬鈴薯甲蟲的發育具有滯育性。

表1 馬鈴薯甲蟲各齡期幼蟲在不同轉基因株系上的發育及死亡情況

2.2.2 轉基因株系田間抗蟲性和產量評價 分別于2009年6月23日和7月7日對田間馬鈴薯甲蟲為害狀況進行調查（表2）。6月份調查時發現，對照為害嚴重，少許不完整葉片上存在大量的馬鈴薯甲蟲，但C3-9轉基因株系葉片基本無為害，其上的馬鈴薯甲蟲很少，且多為很小的若蟲。其他3個轉基因株系也遭到不同程度的為害，其葉片不完整，但有較多葉片，所以百株蟲口數反而高于對照。7月初調查發現，對照僅剩光稈，可C3-9仍然無為害，但其他3個轉基因株系的為害也很嚴重。

表2 轉基因馬鈴薯株系2個生育時期蟲口數和為害情況

后期對所收獲的馬鈴薯塊莖進行測產。由于對照（CK1）為害嚴重，基本無產量，只好使用噴藥的對照（CK2）進行測產（圖2）。C3-9小區產量和噴藥對照很接近，其他株系也受到馬鈴薯甲蟲的為害，減產嚴重。

3 討論

通過ELISA方法對4個轉cry3A基因馬鈴薯品系表達蛋白量進行研究，發現4個轉基因品系中，C3-9的表達量最高，其余依次為C3v-5，C3-11，C3-6。為進一步證實4個轉基因馬鈴薯品系的抗蟲效果，采用對幼蟲死亡率、蟲口自然減退率和產量分析的方法進行研究，結果表明，C3-9品系表現出高的抗蟲性，其葉片的外源毒蛋白含量也顯著高于其他轉基因品系。這說明外源抗蟲蛋白的表達量和抗蟲性是呈正相關的，與報道的轉基因抗蟲棉花、水稻和玉米等結果一致[3-10]。

4個轉基因株系的農藝性狀表現和對照紫花白是一致的。在不噴灑殺蟲農藥時，C3-9具有高抗蟲性，其產量和噴灑農藥的對照相當。而C3v-5，C3-11和C3-6抗蟲效果還不夠理想，根本原因是其毒蛋白的表達量較低造成的。山西省農科院棉花所培育的C3-9可以直接作為高抗馬鈴薯甲蟲的品種進行試種，或者作為育種材料來培育大量的抗蟲馬鈴薯品種。

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