苦參素抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷作用的研究

高鵬

苦參素(matrine)是從豆科植物苦參的干燥根中提取分離精制而得的白色結晶性單體粉末。已有研究表明苦參素具有抗炎、免疫調節、減輕肝臟炎癥活動、抑制肝內膠原合成及抗纖維化作用[1-2]。本實驗通過大鼠肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)模型，探討苦參素對缺血再灌注肝臟細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑 苦參素注射液購于江蘇正大天晴藥業股份有限公司，產品批號0511101。Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫組織化試劑盒購自武漢博士德生物技術公司。

1.2 動物分組與模型建立 8～10周SD大鼠30只，♀♂不限, 體重200～250克。隨機分為空白對照組(S組)、缺血再灌注+生理鹽水組(I/R組)、缺血再灌注+苦參素注射液組(M組)，每組10只。大鼠于術前禁食12h,自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦0.6ml/100g麻醉后，仰臥位固定，行頸部正中切口，鈍性分離出一側頸內動脈，插管以備取血。然后在劍突下行正中腹部切口3～4cm，打開腹腔，暴露肝門，用無損傷血管鉗夾閉門靜脈、肝動脈造成全肝缺血30min后，松夾恢復血流再灌注2h。S組和I/R組于術前30min分別經股靜脈輸注生理鹽水2ml/100g，而M組于術前30min經股靜脈輸注苦參注射液2ml/100g。術畢處死, 取肝組織置于4%甲醛溶液中固定。

1.3 指標檢測及方法 HE觀察組織超微結構改變：取肝組織左葉剪成0.5cm×0.3cm×1.0cm置于4%甲醛溶液中固定24h后，經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，切成4～6um的切片，HE染色，中性膠封固，顯微鏡觀察。

Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達檢測:石蠟切片經脫蠟水化后,滴加3%H2O2滅活內源性酶, 雙蒸水漂洗3次后,進行熱修復抗原、滴加抗原修復液Ⅰ和正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min后，切片分別滴加Caspase-3及Bax、Bcl-2單克隆抗體，37℃孵育60min,同樣以PBS漂洗2分鐘×3次,再滴加生物素化羊抗小鼠IgG37℃孵育20min其間以PBS漂洗2分鐘×3次。接著滴加SABC37℃孵育20min其間以PBS漂洗5分鐘×4次。最后以DAB顯色,蘇木素復染后,封片光鏡下觀察。用PBS做陰性對照。結果判定：細胞漿內和細胞核膜上出現棕黃色顆?；騽蛸|樣棕黃色結構為Caspase-3、Bcl-2和Bax免疫反應陽性細胞。各例切片于光鏡下觀察10個高倍視野，用BI2000醫學圖象分析系統測定每組Caspase-3、Bcl-2和Bax平均光密度值(OD值)。

2 結果

2.1 光鏡下見S組肝小葉、肝細胞、枯否氏細胞及竇內皮細胞形態正常，竇間隙清晰可見。I/R組肝細胞大小不一，小葉周邊竇間隙變窄，甚至消失，肝細胞脂肪變性非常明顯。M組肝臟較I/R組明顯減輕，偶見水腫、變性，小葉周邊竇間隙清晰可見。

2.2 免疫組化法檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達鏡下觀察表明，凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3主要在肝臟細胞的胞漿表達,呈棕色反應,胞核基本不表達。M組Bax OD值明顯低于I/R組(P＜0.05)，略微高于S組(P＞0.05)，而I/R組Bax OD值顯著高于S組(P＜0.01)；I/R組Bcl-2 OD值高于S組(P＜0.05)，且M組Bcl-2 OD值高于S組(P＜0.05)，M組中Bcl-2表達雖強于I/R組,但兩組之間比較差異無顯著性; I/R組Caspase-3 OD值明顯高于S組(P＜0.01)，且明顯高于M組(P＜0.01)(見表1) 。

表1 各組中Bax、Bcl-2和Caspase-3 OD值比較

3 討論

HIRI是肝部分切除及肝移植的主要制約因素之一[3],是導致患者死亡的主要原因。它是指各種原因導致肝血流中斷或不足使肝臟缺血，當恢復血供再灌注后，肝細胞功能代謝障礙及結構破壞反而加重。本實驗HIRI模型通過阻斷全肝血流30min后恢復血流造成肝臟的損傷，從而出現肝細胞的變性和壞死。資料顯示[4]，HIRI與內皮素/一氧化氮的失衡，核因子-kB(NF-kB)的激活，前炎性因子和粘附因子的釋放，氧源性自由基的產生和中性粒細胞的聚集，肝細胞凋亡等因素密切相關。

以往認為壞死是HIRI后細胞死亡的唯一方式，近年來,大量研究資料表明，引起細胞死亡的方式可通過凋亡和壞死兩條途徑。凋亡是HIRI后細胞死亡的主要方式，HIRI后細胞凋亡的發生與缺血的嚴重程度、再灌注時間的長短有關。再灌注能加速細胞凋亡的進程。目前人們對HIRI時細胞凋亡的發生機制研究頗多，尤其是多種基因參與細胞凋亡的調控如bcl-2家族、Caspase家族、TNF受體家族和即早基因(IEGS)家族等。研究表明[5]，脂質過氧化、Bcl-2/Bax和Caspase-3參與肝臟缺血再灌注后細胞損傷過程，并在其中起重要作用。Bcl-2的功能可被結合蛋白所改變，Bax蛋白是同一細胞內Bcl-2的同源基因，二者作用相互拮抗。Bax可與Bcl-2蛋白結合成異二聚體并使之失活，加強表達Bax形成同二聚體將加速細胞死亡。所以Bcl-2和Bax表達水平的平衡結果決定了凋亡信號刺激后細胞存活或凋亡。而Caspase-3是細胞凋亡的效應分子,它在各種生理和病理因素刺激下,通過其家族成員的級聯放大,實施細胞的凋亡, 引起細胞特征性的凋亡形態學上的改變,加重組織或器官的功能損害。有研究發現，HIRI后Bcl-2表達減弱，Bax表達增強，Bcl-2/Bax下降，表明Bcl-2、Bax參與了肝臟保存再灌注中細胞凋亡的調控。因此，通過抑制缺血再灌注過程中細胞凋亡能夠保護肝臟功能。苦參素系由中藥苦豆子中提取的生物堿類，大量研究表明，苦參素有抗HBV作用[6-7]，能消除自由基、保護免疫功能、抗細胞纖維化作用[1-2]。本研究證實：I/R組Bcl-2表達減弱，Bax表達增強，Bcl-2/Bax下降；苦參素組能使Bcl-2表達增強，Bax表達降低，Caspase-3表達也明顯減弱，提示該藥具有抑制肝細胞凋亡和改善肝功能作用，有利于預防HIRI。鑒于苦參素無明顯毒副作用，有望成為很有前途的保護肝臟藥物，其臨床療效還有待進一步深入研究。

[1]施光峰,李謙,翁心華,等.苦參素對大鼠纖維化肝臟組織金屬蛋白酶抑制因子-1、α-平滑肌肌動蛋白表達的影響[J].實用肝臟病雜志,2003,6(3):132-134.

[2]王俊學,王國俊,蔡雄,等.氧化苦參堿對TNFα誘導的人L02肝細胞凋亡的影響[J].肝臟,2001,6:83.

[3]Ferdinand Serracino- Inglott M.D,Nagy A,Habib,etc.Hepatic ischemia-reperfusion injury[J].The American Journal of Surgery,2001,181(2):160-166.

[4]Woodside KJ,Song J,Song W,etc.Immunomodulation of hepatic ischemic injury via increased Bcl-X(L) and decreased Bcl-X(S)[J].J Surg Res,2003,112(1):59-64.

[5]高鵬,張定國,陸小華.大鼠肝臟缺血再灌注損傷對脂質過氧化和Bcl-2/Bax表達的影響[J].肝臟,2006,11(3):186-187.

[6]張玲霞,周霞秋,于巖巖,等.苦參素治療慢性乙型肝炎的臨床研究[J].中華肝臟病雜志,2002,10(4):280-282.

[7]潘正順,余瓊華,嚴鴻,等.苦參素聯合干擾素α-1b治療慢性乙型肝炎的臨床研究[J].中國中西醫結合雜志,2005,25(8):700-703.