堿性成纖維細胞生長因子在大鼠哮喘氣道重塑模型中的表達及地塞米松的干預作用

鞏雪芳 薄建萍 陳俊艷

大量的研究證明許多成纖維細胞因子(fibroblast growth factors，FGFs)在慢性炎癥和組織重塑進程以及慢性氣道疾病如哮喘的纖維化中起作用[1]。堿性成纖維細胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是FGFs龐大家族中的一員，而且是在哮喘病理生理學中研究最多的一員。這個生長因子最早在牛垂體抽提物中發現，基于其刺激成纖維細胞細胞株NIH3T3增殖的能力及其高等電點(PI=9.6)而得名[2]。它在血管發生過程中血管內皮、平滑肌細胞的增殖，損傷愈合過程中成纖維細胞的遷移和增殖，成肌纖維細胞表型的逆轉，以及氣道上皮細胞的遷移和增殖中起作用[3]。本文通過觀察在不同程度氣道重塑情況下血清中bFGF含量的變化，探討bFGF與氣道重塑嚴重程度的相關性及地塞米松干預的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 彩云JWC-201D型超聲霧化器：鞍山市同信醫用儀器廠；BH-2型光學顯微鏡：日本Olympus公司；LY-SUPER HP CCD萬能成像裝置：成都勵揚精密機電有限公司；80-2B型低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；ZS-2板式酶標儀：北京新風機械廠；IMS6.0彩色圖像分析系統：上海申騰信息技術有限公司。

1.1.2 試劑 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)：美國Sigma公司；氫氧化鋁(Aluminum hydroxide，Al(OH)3)：天津化學試劑三廠；bFGF ELISA試劑盒：美國R&D systems公司。

1.1.3 動物 雄性Wistar大鼠40只，2～3月齡，體重160～180g，清潔級，購于河北醫科大學實驗動物中心，室溫20℃飼養，自由進食與飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 按隨機數字表法將40只大鼠分為早期干預組(early-intervention group)、晚期干預組(lateintervention group)、不干預組(non-intervention group)及對照組(control group)，每組10只。

1.2.2 模型建立 實驗第1天，E組、L組和N組每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混懸液(內含生理鹽水加卵蛋白100mg，氫氧化鋁干粉100mg)1ml致敏；C組腹腔注射等量生理鹽水。8天后E組、L組和N組每只大鼠再次腹腔注射10%抗原混懸液1ml；C組腹腔注射等量生理鹽水。第15天，E組、L組和N組開始用1%卵蛋白超聲霧化吸入激發哮喘，每天1次，每次20min，共8周；C組用生理鹽水霧化吸入，每天1次，每次20min，共8周。其中，E組在每次霧化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；從霧化第15天始，L組在每次霧化前1h，每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg；C組用生理鹽水代替，注射劑量相同。

1.2.3 標本制備 每只大鼠于最后一次霧化后24h內用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉，開胸，右心室取血約2ml，于室溫放置2小時后，1000r/min，離心10min，取上清液分裝，-20℃保存待測。同時，取右肺中葉，4%多聚甲醛溶液中固定1周，常規石蠟包埋，切片，做HE染色。

1.2.4 圖像分析 HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內氣管面積(AMe)、平滑肌內緣內氣管面積(AMi)。

計算公式：

支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbm

平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm

衡量氣道重塑程度[4]。

1.2.5 檢測血清bFGF水平 使用ELISA法，按試劑盒說明測定血清中bFGF濃度值。

1.2.6 統計學分析 用SPSS16.0統計軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩個變量間的關系采用線性相關分析，結果用(±s)表示，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 一般情況觀察 N組、E組、L組大鼠初次霧化結束時即出現大汗淋漓，口唇輕度紫紺，腹部翕動，煩躁不安，易激惹，飲水增加。C組大鼠行動敏捷，未見異常。

2.2 計算機圖像分析

2.2.1 HE染色形態學改變 N組肺組織中支氣管上皮細胞脫落，支氣管黏膜皺襞增多，中斷，呼吸道壁增厚，管腔狹窄，黏膜下、管壁及肺泡間質均見有大量炎性細胞浸潤(以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主)；E組支氣管上皮結構基本正常，上皮細胞偶有脫落，黏膜相對完整，呼吸道壁增厚及炎癥細胞浸潤均明顯輕于N組；L組的變化介于上述兩組之間；C組肺組織中幾乎無上述病理改變。

2.2.2 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測定(表1)

2.3 血清中bFGF濃度(見表2，3)

2.4 統計學分析結果

2.4.1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度比較 各組大鼠支氣管壁厚度數據由方差分析得F=518.49，P＜0.01；進一步經LSD-t檢驗，任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統計學意義(P＜0.05)。同樣，各組大鼠氣道平滑肌厚度數據由方差分析得F=271.26，P＜0.01；進一步經LSD-t檢驗，任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2.4.2 各組大鼠血清中bFGF濃度比較 由方差分析得F=132.70，P＜0.01；進一步經LSD-t檢驗，任何兩組間血清中bFGF濃度上的差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2.4.3 各組大鼠血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度及平滑肌厚度之間的關聯性分析 繪散點圖知，血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度呈線性趨勢，Pearson相關系數r=0.93(t=6.16，P＜0.001)，表明血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度間呈線性正相關；同樣，繪散點圖知，血清中bFGF濃度與平滑肌厚度也呈線性趨勢，Pearson相關系數r=0.95(t=18.75，P＜0.001)，表明血清中bFGF濃度與平滑肌厚度間也呈線性正相關。

表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm，±s)

分組 n 支氣管壁厚度 平滑肌厚度N組 10 139.34±5.80 36.93±1.52 E組 10 101.53±2.33 22.22±1.32 L組 10 117.77±1.20 29.24±0.97 C組 10 80.19±2.79 18.47±2.19

表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的濃度(±s，ng/ml)

表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的濃度(±s，ng/ml)

分組 n 血清中bFGF含量(ng/ml)N組 10 0.53±0.04 E組 10 0.34±0.02 L組 10 0.43±0.03 C組 10 0.30±0.03

表3 各組大鼠血清中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)濃度的變異度

3 討論

哮喘氣道重塑最重要的病理變化是上皮剝脫、杯狀細胞化生、上皮下肥厚、氣道平滑肌增生、支氣管腺體肥大、血管生成和細胞外基質(ECM)成分改變[5]。在這些病理變化中，氣道平滑肌增生是哮喘氣道重塑最顯著的特征[6]。有研究表明，bFGF誘導哮喘氣道平滑肌增生[2]，通過增加人氣道平滑肌細胞增殖和遷移、改變其收縮性表型在哮喘氣道重塑中起重要作用[1]。本實驗中，從早期干預組、晚期干預組至不干預組，氣道重塑程度(支氣管壁厚度、平滑肌厚度)逐漸增加，而bFGF濃度也呈上升趨勢，提示bFGF與哮喘氣道重塑嚴重程度相關，經統計學分析，兩者呈線性正相關，由此推測bFGF未來可能成為評價氣道重塑程度、診斷和治療哮喘氣道重塑的關鍵因子。在哮喘治療中糖皮質激素是最有效的抗炎藥物[7]，在本實驗中，應用地塞米松后，早期干預組氣道重塑程度明顯較晚期干預組及不干預組為輕，提示早期地塞米松治療可部分逆轉哮喘氣道重塑，其可能通過下調bFGF起作用。另外本實驗中，早期應用地塞米松效果明顯，可預見用藥時機的選擇是治療哮喘氣道重塑的關鍵之一，在未來可考慮檢測哮喘患者血清bFGF來指導臨床用藥，從這個意義上來說，本實驗可作為一個初步參考，一個因子要作為診斷標準還需進行大量臨床工作，且本實驗為動物實驗，要在人群中明確bFGF是否為哮喘氣道重塑的關鍵因子也需要進一步的臨床研究。

[1]Zou Hui,Nie Xiu-hong,Zhang Yi,et al.Effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation,migration and phenotypic modulation of airway smooth muscle cells[J].Chin Med J,2008,121(5):424-429.

[2]Ynuk Bossé,Marek Rola-Pleszczynski.FGF2 in asthmatic airwaysmooth-muscle-cell hyperplasia[J].Trends Mol Med,2007,14(1):3-11.

[3]Seong Gyu Jeon,Chun Geun Lee,Min-Hee Oh,et al.Recombinant basic fibroblast growth factor inhibits the airway hyperresponsiveness,mucus production,and lung inflammation induced by an allergen challenge[J].J Allergy Clin Immunol,2007,119:831-837.

[4]王傳夏,李昌崇,羅運春,等.支氣管哮喘大鼠氣道重塑中肺泡巨噬細胞的作用[J].中華結核和呼吸雜志,2006,29(11):740-743.

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[6]Etsuko Tagaya,Jun Tamaoki.Mechanisms of Airway Remodeling in Asthma[J].Allergol Int,2007,56:331-340.

[7]David H,Broide.Immunologic and inflammatory mechanisms that drive asthma progression to remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2008,121:560-570.