菠蘿渣淀粉功能降解菌篩選及s2b7-4的鑒定

賀軍軍,羅 萍＊,陳永輝,易潤華,李勤奮

(1.中國熱帶農業科學院湛江實驗站,廣東湛江 524013;2.廣東海洋大學,廣東湛江 524088; 3.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,海南儋州 571737)

菠蘿渣淀粉功能降解菌篩選及s2b7-4的鑒定

賀軍軍1,羅 萍1＊,陳永輝1,易潤華2,李勤奮3

(1.中國熱帶農業科學院湛江實驗站,廣東湛江 524013;2.廣東海洋大學,廣東湛江 524088; 3.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,海南儋州 571737)

為了加快菠蘿渣發酵,本試驗通過利用多種選擇性培養基,從自然發酵的菠蘿渣中分離到多種淀粉分解菌,經過初篩和復篩,獲得了降解菠蘿渣的淀粉降解功能菌株s2b7-1和s2b7-4,篩選出其最適培養基為改良LB培養基及其優化組合。通過形態、生理生化和分子綜合鑒定得出s2b7-4菌株為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

菠蘿渣;淀粉功能降解菌;s2b7-4

菠蘿原名鳳梨,原產巴西,目前已廣泛分布在南北回歸線之間,成為世界重要的果樹之一。16世紀時傳入我國,在廣東、廣西、福建、臺灣等地區大面積栽培種植,種植面積達70000 hm2左右[1]。然而,由于菠蘿保存期較短,收獲后常用來加工罐頭、濃縮汁和蜜餞等,而占全果重50%～60%的菠蘿皮副產品多被堆積廢棄,造成環境污染和資源浪費[2-3]。近年來,隨著國內對廢棄物綜合利用的開發,菠蘿加工副產品在肥料化方面的利用越來越受到重視,但多是通過自然堆放發酵制備有機肥,存在所用時間長、發酵臭氣難處等問題。本研究從微生物加快菠蘿渣發酵熟化的角度出發,通過對不同堆放時間的菠蘿渣中的微生物進行分離、純化和篩選,選出其中的高效降解淀粉菌株,并對其最佳功能培養基進行了篩選及優化,以期為菠蘿渣肥料化的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 菠蘿渣采自廣東省豐收糖業發展有限公司堆積場。

1.1.2 培養基 淀粉培養基(S1):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO42.5 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;淀粉蛋白胨酵母培養基(S2):MgSO40.5 g,KH2PO40.1 g,淀粉12 g,蛋白胨8 g,酵母粉2 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.0;牛肉膏蛋白胨淀粉培養基(S3):NaCl5 g,淀粉2 g,蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良營養肉湯:牛肉膏10 g,蛋白胨5 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良IFFI24M:NaCl 5 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉10 g,酵母膏5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.8;改良NA:NaCl 5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,淀粉15 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.6～7.0;改良LB:NaCl 5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良YPG:NaCl 5 g,玉米粉7 g,蛋白胨20 g,淀粉15 g,酵母膏10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良BPY:馬鈴薯200 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良PDA:馬鈴薯200 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL pH自然;改良BPDB:馬鈴薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;BPsB:馬鈴薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL, pH自然;淀粉培養基:KH2PO40.3 g,MgCO31 g, NaNO31 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH自然;蛋白胨淀粉培養基:蛋白胨0.1 g,淀粉5 g,葡萄糖1 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL, pH自然;酵母膏淀粉培養基:淀粉5 g,酵母膏10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2。分離降解細菌用S1、S2和S3等培養基;菌株篩選用改良營養肉湯、改良IFFI24M、改良NA、改良LB、改良YPG、改良BPY、改良PDA、改良BPDB、BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培養基。

1.2 方法

1.2.1 分離與篩選 稱取菠蘿渣樣品1.00 g,加入無菌水10 mL,在振蕩機上振蕩10 min,形成懸液,吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10-6,取10-6稀釋懸液0.1 mL分別涂布到S1、S2和S3培養基上;28℃黑暗培養4 d,計算菌落數。根據菌落形態、顏色等挑取單菌落,按常規方法純化后保存。菌株篩選采取透明圈法。將分離得到的菌株接種到淀粉培養基平板上,28℃培養24 h后,取出平板,滴加碘液,測量透明圈和菌落的直徑大小,挑選透明圈和菌落的直徑比值較大的菌株保存備用;將初篩獲得的菌株在淀粉培養基平板進一步篩選得到淀粉降解功能菌株。

1.2.2 功能培養基篩選 用改良營養肉湯、IFFI24M、NA、LB、YPG、BPY、PDA、BPDB和BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培養基,進行功能培養基篩選,每處理設3次重復。

1.2.3 功能培養基優化 對功能培養基成分按照正交試驗L9(3)3進行優化,每處理設3個重復。

1.2.4 s2b7-4菌株鑒定 ①常規鑒定:對菌株的菌落形態,菌體形狀、革蘭染色、芽胞染色、耐鹽性、硝酸還原、檸檬酸鹽利用、H2S產生、纖維素分解、明膠液化、淀粉水解、吲哚產生、過氧化氫酶產生、V-P反應以及不同碳源的利用等生長培養特性及生理生化進行了測定。具體參照《常見細菌系統鑒定手冊》[4]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版[5]等文獻;②16S r DNA序列分析:改良的SDS法提取降解菌株s2b7-4和s2b7-1的基因組DNA為模板,以16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,16(-)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3為上下游引物擴增菌株的16S rDNA。其PCR體系為(25μL):模板2μL,上游引物1 μL,下游引物1μL,10×buffer 2.5μL,Mg(25 mmol/L)2.5μL,DNTP(2 mmol/L)2.5μL,Taq (3 U/μL)0.35μL,ddH2O 13.15μL。PCR擴增條件:94℃預變性4 min,94℃變性1 min,50℃退火0.5 min,72℃延伸0.5 min,循環35次;最后72℃保溫10 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標DNA片段,由大連寶生物工程有限公司完成測序,測序結果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較,以Clustal X進行多序列比對后,用MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構建系統發育樹,并進行1000次Bootstraps檢驗。

2 結果與分析

2.1 淀粉降解菌株的分離

從表1可以看出,相同樣品在淀粉培養基(S1)中出現菌落數最多,平均為11.5×107cfu/ g,顯著高于淀粉蛋白胨酵母培養基(S2)和牛肉膏蛋白胨淀粉培養基(S3)的0.25×107cfu/g和0.25×107cfu/g。

表1 培養基對淀粉降解菌分離的影響(單位:107cfu/g)Table 1 Effect of starch degradation strains in different mediums(Unit:107cfu/g)

2.2 功能菌株篩選

采用透明圈法對淀粉降解菌進行篩選,從菠蘿渣中分離了47個菌株,其中40個菌株沒有任何降解能力。7個菌株有降解能力,其透明圈直徑與菌落直徑的比值在0.55～4.0,占分離比例的14.89%(表2)。7個功能菌株中,s2b7-4的比值最大為4.0,s2b7-1次之為2.57。

表2 菠蘿渣淀粉降解菌的篩選Table 2 Screening of starch degrading-bacteria in pineapple residue

2.3 功能菌株復篩

通過采用透明圈法對獲得的初始功能菌株進行復篩,從而確定淀粉降解功能菌株。實驗表明: s2b7-4和s2b7-1菌株的HC值顯然比其他菌株的大,分別為3.75和2.63,被確定為淀粉功能降解菌株(表3)。

2.4 功能培養基篩選

利用功能菌株在不同培養基上的HC值來評價菌株功能發揮的最適培養基。由表4可知: s2b7-1和s2b7-4菌株HC值在12種不同培養基表現不一,均在改良LB培養基上HC值最大,分別為5.05和2.43。故認為改良LB培養基是s2b7-1和s2b7-4菌株功能培養基。

表3 淀粉降解功能菌株篩選Table 3 Screening of starch degrading-bacteria

表4 s2b7-1和s2b7-4菌株在不同培養基HC值Table 4 HC value of s2b7-1 and s2b7-4 strains in different mediums

2.5 功能培養基優化

對s2b7-1和s2b7-4菌株的功能培養基即改良LB培養基中的蛋白胨、NaCl和酵母膏用量進行優化,其優化組分水平如表5所示。試驗結果表明,s2b7-1菌株的最佳培養基為組合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大為4(表6);s2b7-4菌株的最佳培養基為組合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏2.5 g,NaCl 2.5 g,瓊脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大為3.08(表7)。

表5 培養基優化組分水平Table 5 Medium optimization component level

表6 s2b7-1菌株功能培養基優化結果Table 6 Medium optimization results of s2b7-1 strain

2.6 s2b7-1和s2b7-4菌株優化培養基的酶活

通過對s2b7-1和s2b7-4菌株分別在優化培養基上的淀粉降解酶的測定發現:s2b7-1和s2b7-4菌株的酶活性分別為216.46μg/(mL· min)和313.71μg/(mL·min),因此,綜合初篩、復篩和酶活性測定,得出s2b7-4菌株對淀粉具有較強的降解能力。

2.7 功能菌株鑒定

2.7.1 形態特征 形態觀察發現,s2b7-4菌落為圓形,黃色不透明,隨著培養時間的延長,菌落變厚、變干,邊緣鋸齒狀,菌落上有褶皺狀突起,顏色變為淺棕黃色;菌體直桿狀,大小為0.75μm× 2.10μm,周生鞭毛,革蘭染色陽性;產芽胞。表明該菌株為芽胞桿菌(Bacillus sp.)。

2.7.2 生理生化特征 菌株s2b7-4生理生化測定結果(表8),菌株s2b7-4生長溫度范圍為15～45℃,生長的pH范圍為5～9,能夠耐受5%的氯化鈉和0.001%的溶菌酶,參照文獻[4-5],表明該菌株與枯草芽胞桿菌的特征基本相似,因此,菌株可能為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

表8 s2b7-4菌株的生理生化特征Table 8 Physiological and biochemical characteristics of s2b7-4 strain

2.7.3 分子鑒定 提取菌株s2b7-4基因組DNA,通過PCR得到菌株1.5 kb左右的16S rDNA。委托寶生物工程(大連)有限公司測得s2b7-4的16S rDNA部分序列,長度為1461 bp。通過BLAST比較發現:s2b7-4的16S r DNA序列與芽胞桿菌屬細菌的16S r DNA相似,調出其中已鑒定菌株的16S rDNA,用Clustal W進行多重序列對比,用軟件MEGA 4.0按Neighbor-Joining法構建系統發育樹(圖1)。菌株與枯草芽胞桿菌B.subtilissub sp.subtilis IAM 12118T(AB042061)關系最緊密,位于同一分支中,同源性高達99.4%。結合s2b7-4形態特征、培養特征及生理生化指標測定等表型鑒定結果,初步將s2b7-4菌株鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

圖1 鄰接法構建的s2b7-4菌株16S rDNA序列系統發育樹Fig.1 Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of s2b7-4 strain

3 討 論

本文以菠蘿渣堆肥所需菌劑的開發為主,通過對多種分離源的淀粉降解菌進行分離、純化和篩選,獲得了1株淀粉降解功能菌株,并對其最佳培養基進行篩選。通過試驗得出以下結論:①利用多種選擇培養基,經過初篩和復篩,從自然發酵不同階段的菠蘿渣中獲得了2株淀粉降解菌株s2b7-1和s2b7-4;②s2b7-1和s2b7-4菌株最佳功能培養基為改良LB培養基,并對培養基進行了優化,通過優化培養基上的淀粉酶活測定發現, s2b7-4菌株對淀粉降解具有較好的功效;③通過形態、生理生化和分子綜合鑒定得出s2b7-4菌株為枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis。

[1]鄧干然,張勁,李明福,等.我國菠蘿葉纖維發展前景分析[J].中國麻業科學,2009,31(4):274-277.

[2]黃發新,詹云輝.菠蘿皮渣釀制白蘭地的初步研究[J].廣西熱作科技,1997,(2):31-35.

[3]楊禮富,謝貴水.菠蘿加工廢料—果皮渣的綜合利用[J].熱帶農業科學,2002,22(4):61-70.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[5]RE布坎南,NE吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)[M].北京:科學出版社,1984.

Screening of Functional Starch-Degrading Bacteria from Pineapple Dregs and Identification of s2b7-4

HE Jun-jun1,LUO Ping1,CHEN Yong-hui1,YI Run-hua2,L IQin-fen3
(1.Zhanjiang Res.Sta.,CATAS,Guangdong,524013;2. Guangdong Ocean Uni.,Zhanjiang,Guangdong,524088; 3.Envir.&Plant Prot.Res.Inst.,CATAS,Danzhou,Hainan,571737)

In order to accelerate the fermentation of pineapple residue,multiple starch-degrading bacteria were isolated from naturally fermented pineapple dregs using selective media in this experiment.Functional strains s2b7-1 and s2b7-4 that were capable of degrading starch in pineapple residue,were obtained through screening and re-screenings, an improved the most suitable medium LB and its optimized combination were also screened.Strain s2b7-4 was identified comprehensively as Bacillus subtilis according to its morphological,physiological,bio-chemical and molecular characteristics.

pineapple residue;functional starch-degrading bacteria;s2b7-4

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0060-05

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金環境與植物保護研究所資助項目(2009hzs1J033)

賀軍軍 男,研究實習員。研究方向為資源開發與利用。Tel:0759-2192696,E-mail:hbj46@163.com

＊通訊作者。Tel:0759-2166419,E-mail:luoping428@163.com

2010-10-23;

2010-11-12