OmpR 與PhoP高滲應激下交叉調節傷寒沙門菌基因表達

生秀梅,徐順高,張海方,許化溪,黃新祥

（江蘇大學醫學技術學院,江蘇鎮江替換為 212013）

OmpR 與PhoP高滲應激下交叉調節傷寒沙門菌基因表達

生秀梅,徐順高,張海方,許化溪,黃新祥＊

（江蘇大學醫學技術學院,江蘇鎮江替換為 212013）

為了探尋OmpR和PhoP之間的交叉調節關系,構建了 ompR-phoP雙缺陷變異株,運用基因芯片分析技術比較了傷寒沙門菌ompR缺陷株、phoP缺陷株及ompR-phoP雙缺陷株之間基因表達譜的差異.結果顯示OmpR與PhoP共同激活11個基因的轉錄,主要為外膜孔蛋白相關基因、脂多糖修飾相關基因等,兩者在調節特定的膜蛋白、孔蛋白及表面結構成分的表達水平方面發揮著協同作用,OmpR與PhoP對未知功能蛋白基因t0563、t0564也具有協同激活效應,值得進一步關注.OmpR與PhoP共同抑制 nanT的轉錄,阻止唾液酸的轉運.另外,ompR缺陷株和phoP缺陷株中未見變化,而ompR-phoP雙缺陷變異株中差異表達基因也可能是OmpR和PhoP的共同調節元,但需要進一步驗證.

傷寒沙門菌;OmpR;PhoP;基因表達調節

傷寒沙門菌（S almvnelia entenicaserovar Typhi,S.Typhi）是一種具有鞭毛的革蘭陰性人類腸道致病菌,也是一種重要的原核生物研究用模式菌[1-3].傷寒沙門菌進入人體后遭遇多種環境的脅迫,如胃部的強酸,腸道的高滲和膽汁,網狀內皮細胞的高氧等[4].此時,傷寒沙門菌通過啟動胞內由細胞膜上特殊的感受分子與胞內的效應調節分子相偶聯構成的雙組分調節系統（two-component regulatory system）對環境進行應答,調節基因表達和代謝反應,從而得以在人體內生存并感染宿主細胞[5-7].目前,在沙門菌和埃希菌（Escherichia）中已發現有數10種雙組分調節系統[8].EnvZ/OmpR和PhoQ/PhoP為兩對較為重要的雙組份調節系統.其中OmpR是目前腸桿菌科中研究最多的滲透壓調節因子,能協同調節某些細菌毒力基因的表達;PhoP則主要參與細菌的毒性及細菌對環境應激的耐受能力等有關的調節[9-12].

近年來有研究發現,不同雙組分調節系統之間存在著網絡化交叉調節作用,如 E.coliK-12中的AcrB/ArcA和 EnvZ/OmpR,在厭氧條件下能共同調節外膜孔蛋白的表達[13],傷寒沙門菌 SPI-2基因的表達受到調節因子SsrB和OmpR的雙重影響等[14].本室前期基于沙門菌基因組寡核苷酸芯片進行的相關研究中發現,在高滲應激初期,OmpR和PhoP均明顯上調,提示高滲應激條件下OmpR、PhoP可能存在交叉調節作用[15].

鑒于此,本研究將應用傷寒沙門菌全基因組DNA芯片基因表達譜技術比較野生型傷寒沙門菌、傷寒沙門菌om pR缺陷株、phoP缺陷株及ompR-phoP雙缺陷株之間基因表達譜的差異以期獲得OmpR、PhoP以及OmpR和 PhoP共同調節的靶基因,為闡明細菌基因表達調控網絡提供證據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 傷寒沙門菌 GIFU10007、大腸埃希菌 E.coliSPY372λpir、自殺質粒 p GMB151為日本岐阜大學惠贈,本室保存;傷寒沙門菌 GIFU10007ompR基因缺陷型變異株、phoP基因缺陷型變異株及攜帶有傷寒沙門菌 phoP基因缺陷性同源片段的自殺質粒的大腸埃希菌 E.coli SPY372λpir為本室制備.

1.1.2主要試劑 rTaqDNA聚合酶、緩沖液和dN TPs均購自 TaKaRa公司（大連）;質粒提取試劑盒購自 Promega公司（美國）;熒光染料Cy3、Cy5購自 Amersham Pharmacia biotech公司（美國）;總 RNA提取試劑盒購自 QIA GEN公司（美國）;反轉錄試劑盒購自 Invitrogen公司（美國）;傷寒沙門菌基因組DNA芯片為本室制備[16].

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀（Mastercycler Personal,Eppendorf公司,德國）;凝膠成像系統（Gene Genius Bioimaging system,Gene 公司 ,美國）;電轉化儀（BIO RAD Gene PulseroII,Bio-Rad公司,美國）;核酸檢測儀（ND-1000 Spectrophotometer,NanoDrop公司,美國）;熒光定量 PCR儀（Rotor-Gene 2000 Real-Time Amplification RC-2072,Corbett Research公司,澳大利亞）;基因芯片雜交儀（hybrigene HB-3D,Hybrigene公司,英國）;基因芯片掃描儀（GenePixTMPersonal 4100A,Axon Instruments公司,美國）.

1.2 方法

1.2.1 傷寒沙門菌om pR-phoP雙缺陷株的制備將傷寒沙門菌GIFU10007ompR基因缺陷型變異株培養至對數生長期,以0℃滅菌水洗滌制成所需的電擊感受態細菌.使用質粒提取試劑盒按說明書操作從攜帶有傷寒沙門菌 phoP基因缺陷性同源片段的自殺質粒的大腸埃希菌 E.coliSPY372 λpir中提取含phoP基因缺陷性同源片段的重組自殺質粒.取2μg該質粒與40μL的電擊感受態ompR基因缺陷型變異株細胞溶液混合后,加到預冷的電極杯中.電擊參數:電容 25μF,電壓2.4 kV.電擊后立即轉入1 mL 37℃預溫的SOC營養液中,37℃小幅振搖溫浴1h后,接種于LB-氨芐青霉素和鏈霉素平板,37℃過夜培養.由于自殺質粒帶有氨芐青霉素和鏈霉素抗性基因,首先在含氨芐青霉素和鏈霉素的LB平板上篩選抗性菌落,增菌培養后,再利用自殺質粒帶有的sacB基因特性,在含5%蔗糖的LB平板上篩選耐蔗糖菌落[17].因 phoP基因缺陷性同源性核苷酸片段與原片段大小有差異,可用PCR觀察細菌的重組現象,篩選用引物序列為 （P1:5’-TAGGATCCATCTGACCGACTCAACCGTC,P2:5’-AAGGATCCGAA-TGGTATCGACCACCACG）.選重組變異株連續傳代培養,將連續3次傳代都有穩定的完全重組的菌株作為 phoP-ompR基因雙缺陷變異株.

1.2.2 細菌培養及總RNA提取 挑取傷寒沙門菌野生株、ompR基因缺陷變異株、phoP基因缺陷變異株、ompR-phoP雙缺陷變異株菌落,分別接種于1 mL低滲LB培養基中,37℃振蕩（220 r/min）培養過夜,以 1∶100分別轉種于30 mL低滲LB培養基中（50 mmol/L NaCl）,37℃振蕩（220 r/min）培養4 h至對數生長期,向其中加入1.6 mL 5 mol/L的 NaCl溶液（此時為高滲LB培養基,300 mmol/L NaCl）,繼續培養30 min,冰上放置 10 min后離心（4℃,4 000 r/min,10 min）,棄上清,收集菌體.TE buffer-溶菌酶（0.6 mg/mL,p H 8.0）結合磁珠 MORA-EXTRACT（AMR,日本）室溫振蕩4 min破壁溶菌,RNaeasy mini column（QIAGEN）試劑盒,按說明書操作提取細菌總RNA,用ND-1000 Spectrophotometer（NanoDrop）測濃度及純度,并取少量于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察質量,DNaseI消化痕量的DNA后,-70℃保存待用.傷寒沙門菌野生株重復6次,其余菌株重復2次.

1.2.3 RNA反轉錄與cDNA熒光標記 取細菌總RNA各20μg,9堿基隨機引物（N9）、基因組特異性引物（genome directed primers,GDP）[18]和反轉錄酶（SuperScript III,Invitrogen）進行反轉錄,采用熒光互標策略獲得Cy3或Cy5標記cDNA.其中野生型傷寒沙門菌采用C y3標記時,其余菌株均用Cy5標記,野生株用Cy5標記時,其余菌株則用Cy3標記.標記產物純化后各種缺陷變異株與野生株混合配對與傷寒沙門菌基因組DNA芯片進行雜交（42℃,18 h）.具體操作詳見參考文獻[16].

1.2.4 芯片掃描及數據分析 芯片雜交后用 GenePix Personal 4100A芯片掃描儀（Axon Instruments）掃描芯片,采用 GenePix Pro 6.0軟件（Axon Instruments）并輔以 Excel軟件進行圖片處理和數據分析.計算扣除背景后的各樣點熒光信號值（均值）.采用全局歸一法（global normalization）對雙色熒光數據進行標準化處理.并計算每個點雜交后不同熒光物質標記所得信號比值（Ratio）,以log（2）Ratio值描述結果,取-1和1（表達1倍差異）作為閾值.

2 結果與討論

2.1 傷寒沙門菌ompR-phoP雙缺陷株的制備

通過將含 phoP基因缺陷性同源片段的重組自殺質粒p GMB151以電轉法引入到 GIFU10007ompR基因缺陷變異株中.首先在氨芐青霉素和鏈霉素平板上篩選抗性菌落,在5%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落,用PCR觀察其重組變異情況.圖1為電轉后重組菌株的鑒定,z66為傷寒沙門菌特有基因,所挑選菌落檢測結果均為陽性,且 PCR擴增ompR基因的結果顯示挑選菌落與野生株相比片段較小,而PCR擴增 phoP基因的結果顯示除了野生株和1號菌株外全部顯示雙條帶,說明含phoP基因缺陷性同源片段的重組自殺質粒p GMB151已成功轉入 GIFU10007ompR基因缺陷變異株中.首次經LB-蔗糖平板篩選的菌落用PCR觀察結果,大部分細菌出現大小兩個片段,即共價整合體,挑選其中小片段占優勢的菌落繼續篩選得到完全重組菌株后,在LB平板上連續傳代4次,篩選結果均僅有小片段出現（如圖2）,顯示已完全重組,說明該菌株已成為穩定的變異株.

圖1 電轉后重組菌株的鑒定Fig.1 Zdentification of recombinant strains after electroporation

圖2 重組菌第4次傳代后PCR鑒定結果Fig.2 PCR results of recombinant Strains artentnansrer for 4 times

2.2 高滲應激后野生株和缺陷株基因表達譜差異

圖3和圖4顯示了傷寒沙門菌ompR缺陷株、phoP缺陷株以及ompR-phoP雙缺陷變異株在高滲應激條件下的基因轉錄情況.從圖中可以看出傷寒沙門菌OmpR和PhoP在高滲應激條件下存在著交叉調節作用、同時也具有各自的調節元.

圖3 高滲應激30 min 3種傷寒沙門菌缺陷變異株中共同轉錄下調的基因數目Fig.3 Gene numbers down-regnlated simdtaneously in three deletion mutant strains ofS.Typhi upon up-shift high osmotic treatment for 30 min

圖4 高滲應激30 min 3種傷寒沙門菌缺陷變異株中共同轉錄上調的基因數目Fig.4 Gene numbers up-regulatal simul to neously in three deletion mutant stnains ofS.Typhiuponup-shift high osmotic treatment for 30 min

2.2.1 高滲應激后ompR單缺陷變異株的基因表達譜分析 將熒光信號較低的不可信數據剔除,對余下數據進行分析,結果顯示,在高滲應激30 min,傷寒沙門菌ompR單缺陷變異株相對于野生株而言,有321個基因具有顯著的表達差異.其中206個基因表達下調,115個基因表達上調.

高滲應激30 min,ompR突變株中,om pC和omp F相對于野生株而言分別下調12倍和5倍.大腸桿菌om pC和omp F基因編碼主要外膜孔蛋白OmpC和OmpF,是 EnvZ/OmpR二元調控系統研究最為詳盡的靶標基因[13].我們的研究結果也顯示高滲應激條件下,傷寒沙門菌OmpR能誘導主要外膜孔蛋白OmpC和OmpF的轉錄.

與Vi抗原合成相關的基因簇（vexAB CD E、tviAB CD E）在高滲應激30 min全部下調,且大多下調5倍以上,提示OmpR參與調節Vi莢膜抗原的合成;編碼 RNA聚合酶α、β、β亞基基因（rpo-AB C等）下調2～2.5倍,延伸因子 Ts（tsf）下調2倍,說明OmpR對傷寒沙門菌基因的表達具有整體調控作用.

細菌的許多功能如 TCA循環、氨基酸代謝、糖代謝、鐵吸收以及各類化合物的結合和轉運,能量的生成等對細菌自身的生長都是至關重要的.細菌缺失了某些重要調控基因,將使得上述細胞功能改變或代償性調節,以應對突變株引起的生長缺陷.從本研究結果來看,編碼ATP合酶各亞基基因（atpAB CD EFGH）均轉錄下調3倍以上,編碼物質及能量代謝相關基因（如糖代謝相關 leuB C、f ruA、otsAB、treB C、aceAB K 等、硫代謝相關基因cysA KJ W P等、nuoIJ M N等）明顯下調;大部分編碼核糖體蛋白合成和修飾、成熟等相關基因（rpl簇,rps簇,rpm簇）均有所下調;下調基因中有部分未知功能基因,從基因所處位置來看,有些基因位于同一操縱子內,可能由同一個啟動子啟動轉錄,值得進一步探討.pmrD、pmrF、slyA等受PhoP調節的基因亦有所下調,提示 OmpR和PhoP具有相同的調節元.

高滲應激30 min,相對于野生株而言,om pR突變株中上調基因主要是鞭毛、動力、趨化及毒力島相關基因（f lgBD E H IL M N,f liS,f lhAB C,motA,cheAB M Z,sscAB,sseF等）.編碼與物質的轉運和結合有關蛋白的基因（f ruB K、uxuAB、uxaC、glpD EF KR T X、srlMR等）及氨基酸代謝相關基因（hutCU H、aspA）也表達上調,說明 Om pR對這些基因的調控是負向的.

2.2.2 高滲應激后 phoP單缺陷變異株的基因表達譜分析 PhoP與PhoQ構成雙組份調節系統,參與脂多糖（LPS）的修飾及環境Mg2+及p H變化引起的胞內基因表達調節[19-20].本研究比較了高滲應激30 min,傷寒沙門菌 phoP單缺陷變異株與野生株表達譜差異.結果顯示,有106個基因具有表達差異,其中37個基因轉錄上調,69個基因轉錄下調.

與毒力相關基因如 pag P、mgtC、pmrD F等以及轉位酶基因 prlA等表達下調,說明轉錄因子PhoP高滲條件下能夠激活抗吞噬因子.許多負責核糖體蛋白合成和修飾、核糖體成熟、蛋白質翻譯和修飾以及RNA合成的基因下調,說明 PhoP對傷寒沙門菌基因的整體表達亦具有調節作用.gst表達下調8倍,gst編碼的谷胱甘肽S-轉移酶具有過氧化酶活性,能保護細胞免受 H2O2損傷.與滲透壓相關基因 ompC、env Z也表達下調,再次提示PhoP與OmpR之間存在交叉調節作用.參與能量代謝、呼吸鏈組分、氨基酸代謝、糖的合成與轉運、大小分子的降解等相關基因的表達水平下調,表明phoP突變株在高滲應激條件下的代謝過程較野生株明顯減慢.此外,有些未知功能蛋白下調倍數達8倍以上,如 t0563、t0564,有必要進一步研究.

phoP突變株在高滲應激條件下上調基因主要與各種分子的轉運、電子傳遞鏈及噬菌體休克蛋白相關.psp位點編碼噬菌體休克蛋白,該位點最早發現于大腸桿菌中,能輔助細菌在靜止期晚期的堿性p H值中存活,被認為在細菌適應宿主生態位中發揮重要作用[21].

2.2.3 高滲應激后ompR-phoP雙缺陷變異株的基因表達譜分析 為了揭示 om pR和 phoP交叉調節網絡,本研究比較了高滲應激30 min,傷寒沙門菌ompR-phoP雙缺陷變異株與野生株表達譜差異.結果顯示,有340個基因具有表達差異,其中210個基因轉錄上調,130個基因轉錄下調.

om pR-phoP雙缺陷變異株下調基因中有43個在ompR單缺陷株中下調,為OmpR調節元;29個在 phoP單缺陷株中下調,為PhoP調節元;其中11個在2個單缺陷株及雙缺陷株中全部下調,為OmpR、PhoP共同調節元.表1列出了3種缺陷株在高滲應激30 min相對于野生株全部上、下調的基因.這些共同下調的基因多為外膜孔蛋白相關基因、脂多糖修飾相關基因,說明兩者在調節特定的膜蛋白、孔蛋白及表面結構成分的表達水平方面發揮著協同作用.未知功能蛋白 t0563、t0564在3種缺陷株中均表達明顯下調,本室在后續研究中將重點關注.

om pR-phoP雙缺陷變異株上調基因中有24個在ompR單缺陷株中上調;只有4個在 phoP單缺陷株中上調;其中3個缺陷株中全部上調的基因只有1個（nanT,參與唾液酸的轉運,見表1）.

om pR缺陷株和 phoP缺陷株中未見變化,而ompR-phoP雙缺陷變異株中具有表達差異的基因多為 TCA循環、氨基酸代謝、糖代謝、脂代謝等相關基因,OmpR和PhoP為2個重要的中央調節因子,細菌在同時缺失 om pR和 phoP后,細菌可能通過其他代償途徑維持細菌的存活和生長,這些基因也可能是OmpR和PhoP的共同調節元,但需要進一步驗證.

表1 3種缺陷株在高滲應激30 min相對于野生株全部上、下調基因Tab.1 Genes up/down-regulatde in thre deletion mutant strans compared to the wild-type strain ofS.Typhiupon up-shift high osmotic treatment for 30 min

3 小結

EnvZ/OmpR和PhoQ/PhoP為兩對較為重要的雙組份調節系統.不同雙組分調節系統之間存在著網絡化交叉調節作用.為了探尋OmpR和PhoP之間的交叉調節關系,我們比較了傷寒沙門菌ompR缺陷株、phoP缺陷株及om pR-phoP雙缺陷株之間基因表達譜的差異,結果顯示OmpR與PhoP共同激活外膜孔蛋白相關基因、脂多糖修飾相關基因等的轉錄,兩者在調節特定的膜蛋白、孔蛋白及表面結構成分的表達水平方面發揮著協同作用.OmpR與 PhoP共同抑制 nanT的轉錄,提示兩者可能同時阻止唾液酸的轉運.OmpR與PhoP對未知功能蛋白 t0563、t0564的協同效應,t0563、t0564的功能,以及OmpR與PhoP具體的交叉調節機制仍有待于進一步闡明.我們的研究結果獲得了部分OmpR、PhoP以及OmpR和 PhoP共同調節的靶基因,為闡明細菌基因表達調控網絡提供了一定基礎.

[1]Everest P,Wain J,Roberts M,et al.The molecular mechanisms of severe typhoid fever[J].Trends Microbiol,2001,9:316-320.

[2]Altier C.Genetic and Environmental Control of Salmonella Invasion[J].J Microbiol,2005,43:85-92.

[3]Jones B D.Salmonella Invasion Gene Regulation:A Story of Environmental Awareness[J].Journal Microbiol,2005,43:110-117.

[4]Pickard D,Li J,Roberts M,et al.Characterization of defined ompR mutants of Salmonella typhi:ompR is involved in the regulation of Vi polysaccharide expression[J].Infect Immun,1994,62:3984-3993.

[5]Nixon B T,Ronson C W,Ausubel F M.Two-component regulatory systems responsive to environmental stimuli share strongly conserved domains with the nitrogen assimilation regulatory genes ntrB and ntrC[J].PNAS USA,1986,83:7850-7854.

[6]Igo M M,Slauch J M,Silhavy T J.Signal transduction in bacteria:kinases that control gene expression[J].New Biol,1990,2:5-9.

[7]Kenney L J.Structure/function relationships in OmpR and other winged-helix transcription factors[J].Curr Opin Microbiol,2002,5:135-141.

[8]Yamamoto K,Hirao K,Oshima T,et al.Functional characterization in vitro of all two-component signal transduction systems from Escherichia coli[J].J Biol Chem,2005,280:1448-1456.

[9]Brzostek K,Raczkowska A,Zasada A.The osmotic regulator OmpR is involved in the response of Yersinia enterocolitica O:9 to environmental stresses and survival within macrophages[J].FEMS Microbiol Lett,2003,228:265-271.

[10]Bernardini M L,Fontaine A,Sansonetti P J.The two-component regulatory system ompR-envZ controls the virulence of Shigella flexneri[J].J Bacteriol,1990,172:6274-6281.

[11]Bang I S,Kim B H,Foster J W,et al.OmpR regulates the stationary-phase acid tolerance response of Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].J Bacteriol,2000,182:2245-2252.

[12]Miller S I,Kukral A M,Mekalanos J J.A two-componentregulatory system（PhoP-PhoQ）controls Salmonella typhimurium virulence[J].PNAS USA,1989,86（13）:5054-5058.

[13]Cai SJ,Inouye M.EnvZ-OmpR Interaction and Osmoregulation in Escherichia coli[J].J Biolog Chem,2002,277（27）:24155-24161.

[14]Feng X,Walthers D,Oropeza R,et al.The response regulator SsrB activates transcription and binds to a region overlapping OmpR binding sites at Salmonella pathogenicity island[J].Mol Microbiol,2004,54:823-35.

[15]Huang X X,Xu H X,Xu S G,et al.Genomic oligo microarray analysis of global transcriptional expression by Salmonella enterica serovar Typhi during hyperosmotic stress[J].Int J Mol Sci,2007,8:116-135.

[16]生秀梅,黃新祥,茅凌翔,等.傷寒沙門菌基因組DNA芯片的制備與基因表達譜分析應用[J].生物化學與生物物理進展,2009,36:206-212.

[17]Huang X X,Phung L V,Dejsirilert S R.et al.Cloning and characterization of the gene encoding the z66 antigen of Salmonella enterica serovar Typhi[J].FEMS Microbiol Lett,2004,234:239-246.

[18]Talat A M,Hunter P,Johnston S A.Genome-directed primers for selective labeling of bacterial transcripts for DNA microarray analysis[J].Nat Biotechnol,2000,18:679-682.

[19]Hitchen P G,Prior J L,Oyston P C,et al.Structural characterization of lipo-oligosaccharide（LOS）from Yersinia pestis:regulation of LOS structure by the PhoPQ system[J].Mol Microbiol,2002,44（6）:1637-1650.

[20]Oyston PC,Dorrell N,Williams K,et al.The response regulator PhoP is important for survival under conditions of macrophage-induced stress and virulence in Yersinia pestis[J].Infect Immun,2000,68（6）:3419-3425.

[21]Model P,Jovanovic G,Dworkin J.The Escherichia coli phage-shock-protein（psp）operon[J].Mol Microbiol,1997,24（2）:255-261.

Abstract:To explore the cross-regulation network of OmpR and PhoP,om pR-phoPdeletion mutant strain was constructed,andS.Ty phigenomic DNA microarray was used to compare the global transcriptional difference betweenompRmutant strain,phoPmutant strain,ompR-phoPmutant strain,and the wild-type strain upon up-shift high osmotic stress.The results showed that transcription of 11 genes were activated and 1 gene was inhibited simultaneously by OmpR and PhoP,respectively.These activated genes encoded outer membrane proteins and lipopolysaccharide modification proteins,which indicated that OmpR and PhoP can together promote the expression of membrane protein,porin and structrual component of bacterial surface.Furthermore,among these activated genes,t0563andt0564with unknown functions are worth further research.On the other hand,OmpR and PhoP inhibited the transcription of nanT simultaneously to prevent the transport of sialic acid.Genes with transcriptional difference only observed inom pR-phoPmutant strain may also be the regulon of OmpR and PhoP.

Key words:S almonella entericaserovar Typhi;OmpR;PhoP;gene expression regulating

OmpRand PhoP cross-regulate gene expression ofSalmonella entericaserovar Typhi under up-shift high osmotic stress

SHENG Xiumei,XU Shungao,ZHANG Haifang,XU Huangxi,HUANG Xinxiang
（School of Medical Technology,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013）

R378.2+3;Q786

A

1000-1190（2010）04-0633-06

2010-06-10.

國家自然科學基金項目（30570088）;江蘇省高校自然科學基金項目（08KJD310012）.

＊通訊聯系人.E-mail:huxinx@yahoo.com.hk.