園參根不同部位雙向電泳圖譜的比較分析

孫立偉,馬朋濤,2,麻 銳,雷秀娟,陳雪楠,祁 超

（1.北華大學(xué)生命科學(xué)中心,吉林132013;2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢替換為 430079）

園參根不同部位雙向電泳圖譜的比較分析

孫立偉1,馬朋濤1,2,麻 銳1,雷秀娟1,陳雪楠1,祁 超2＊

（1.北華大學(xué)生命科學(xué)中心,吉林132013;2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢替換為 430079）

通過(guò)對(duì)經(jīng)典 TCA-丙酮提取法加以?xún)?yōu)化,結(jié)合超聲破碎技術(shù),建立了園參蘆頭、主根、須根、表皮等4個(gè)不同部位的雙向電泳圖譜,采用Image Master 2D Platinum 6.0對(duì)其進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)了人參不同部位13個(gè)相同的蛋白點(diǎn),并在主根中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)特異點(diǎn),在蘆頭和表皮中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異點(diǎn),在須根中發(fā)現(xiàn)了1組特異點(diǎn)群（3個(gè)點(diǎn)）.另外,還發(fā)現(xiàn)了2個(gè)蛋白出現(xiàn)明顯表達(dá)差異的區(qū)域,從而為建立在蛋白分子水平上人參內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒定方法提供依據(jù),豐富了其內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系.

人參不同部位;雙向電泳;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)

人參 （Panax ginsengC.A.Meyer）是一種傳統(tǒng)名貴中藥,主要以根部入藥,其藥理學(xué)活性成分以人參皂苷為主,具有抗衰老,抗輻射,抗乳癌（雌激素活性）,促進(jìn)血管生成,治療心腦血管疾病等作用[1-6].據(jù)神農(nóng)本草經(jīng)和現(xiàn)代人參研究表明,人參根部各部分藥效成分和含量不盡相同,具有不同的藥理學(xué)效用[7-9].目前我國(guó)市場(chǎng)上出售的主要是種植人參,也稱(chēng)園參,其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)主要以外觀和人參皂苷含量為主[10-13].但僅以這些指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)還不夠完善,尤其對(duì)這些具有同一基因型個(gè)體的不同部位還很難進(jìn)行有效質(zhì)量評(píng)價(jià).所以制定一個(gè)科學(xué)、有效的人參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系十分必要.

蛋白質(zhì)作為植物體內(nèi)基因表達(dá)的最終產(chǎn)物能夠在蛋白分子水平真實(shí)反應(yīng)生物體內(nèi)基因表達(dá)的變化.近年來(lái)隨著植物蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展和植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)植物體不同部位的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行研究,對(duì)于探尋不同部位科學(xué)有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是十分必要的[14-16].

2002 年John等[9]首次利用雙向電泳（2-DE）技術(shù)對(duì)高麗參不同部位和美國(guó)產(chǎn)西洋參主根蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行了比較研究.研究表明利用各2-DE圖譜模式的不同,可以鑒別高麗參不同部位和美國(guó)產(chǎn)西洋參主根.這也為中國(guó)園參不同部位的鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考和可行性.但由于當(dāng)時(shí)提取方法和質(zhì)譜靈敏度的限制,其得到的2-DE圖譜僅有較少的蛋白點(diǎn),并且只針對(duì)其中6個(gè)相同點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定和分析,遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到對(duì)園參不同部位蛋白表達(dá)差異研究的需求.為此,針對(duì)中國(guó)園參富含多糖、多酚、皂苷、核酸等干擾物質(zhì)的特點(diǎn)[17],優(yōu)化了其蛋白提取方法,得到了園參不同部位的2-DE圖譜,并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析,為園參根不同部位的鑒別提供了科學(xué)有效的理論依據(jù),并為其內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系的完善奠定了蛋白分子水平基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮5年生園參樣品產(chǎn)自吉林撫松地區(qū).參考John等[9]的分部位方法,將樣品分為須根、蘆頭、主根、表皮4部位.各部位樣品用去離子水洗凈晾干后,加入液氮研磨,待成粉末后,放于-80℃冰箱凍存待用.

1.2 主要試劑

Acr、Bis、Glycine、SDS、Tris、TEMED、Urea、Glycerol、β-Mercaptoethanol、SB3-10、TCEP 均購(gòu)自美國(guó) Amresco公司;AP、Thiourea、CHAPS、PMSF、CBB R-250、CBB G-250、Bromophenol blue購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;Protein inhibitors、Agar-ose、Marker購(gòu)自美國(guó) Promega公司;DTT、IAA購(gòu)自德國(guó) Merck公司;BSA購(gòu)自日本 TaKaRa公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品蛋白提取 稱(chēng)取分部位樣品粉末各0.25 g,分別加入7倍體積（w/v）-20℃預(yù)冷丙酮（含體積分?jǐn)?shù)為10%的TCA和體積分?jǐn)?shù)為0.07%β-巰基乙醇）,旋渦混勻后于 -20℃放置 2 h,15 000 r/min、4℃條件下離心15 min棄上清,取沉淀,沉淀用預(yù)冷丙酮清洗至少3次,-20℃放置待沉淀中丙酮完全揮發(fā)后,加入4倍體積裂解液（7 mol Urea,2 mol Thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,1%PMSF,1%蛋白酶抑制劑）,旋渦混勻,100 W超聲40 min后,15 000 r/min、4℃條件下離心15 min,收集蛋白上清液.

1.3.2 蛋白含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物,參照Bradford法[18]稍做改進(jìn),進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定.

1.3.3 2-DE 取適量蛋白上清液（250μg）,加入樣品再水化液（5 mol Urea,2 mol Thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,0.65%3-10IPG buffer,0.35%4-7 IPG buffer）至終體積125μL后,加入到IPG膠條槽,進(jìn)行樣品再水化和等電聚焦（IEF）.IPG膠條規(guī)格為7 cm p H 3～10 L（GE Healthcare）,等電聚焦選用Ettan IPGPhorII（Amersham Biosciences）等電聚焦儀,聚焦程序設(shè)置如下:step 1:Step 30 V 11 h;step 2:Step 100 V 1 h;step 3:Grad 500 V 1 h;step 4:Grad 1 000 V 2 h;step 5:Grad 5 000 V 4 000 Vhr;step 6:Step 5 000 V 6 000 Vhr;二向 SDS-PAGE,選用 Hofer Mini-VE（Amersham Biosciences）電泳槽,12.5%分離膠（10×11×0.1）,5 mA/gel,轉(zhuǎn)移 15 min,10 mA/gel分離3 h后,考馬斯亮藍(lán)R-250染色.

1.3.4 圖像掃描及對(duì)比分析 使用 Image scanner掃描儀進(jìn)行圖像掃描.掃描儀參數(shù)設(shè)置為256階灰度、600 dpi分辨率,圖像保存為 TIFF格式.掃描后的圖像用Image Master 2D Platinum Software Version 6.0進(jìn)行處理、分析,包括蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、匹配、數(shù)據(jù)分析和輸出等,找出各部位的差異點(diǎn),并對(duì)其進(jìn)行初步分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 園參蛋白提取方法的優(yōu)化

蛋白提取的質(zhì)量是2-DE成功分離蛋白的前提和關(guān)鍵.作為一種具有廣泛藥理學(xué)活性的中藥,園參根富含皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種次生代謝物質(zhì),同時(shí)作為一種植物儲(chǔ)存器官,其根細(xì)胞又含有較厚的細(xì)胞壁和大量的淀粉、多酚、核酸、色素等化學(xué)成分[17].多種次生代謝物質(zhì)和化學(xué)成分的存在使得很難利用常規(guī)的蛋白提取方法制備出高純度的樣品總蛋白,嚴(yán)重影響了2-DE圖譜的質(zhì)量[19-21].為此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合上述園參的特性,對(duì)常規(guī)的 TCA/丙酮沉淀法進(jìn)行了大量的條件摸索與優(yōu)化（結(jié)果未顯示）,比較了不同的細(xì)胞破碎方法和裂解液配方之間的組合效果,最終確定了采用超聲方法細(xì)胞破碎和優(yōu)化的TCA/丙酮沉淀法相結(jié)合的蛋白提取方法.超聲波是一種強(qiáng)有力的物理波,它產(chǎn)生的剪切力在將細(xì)胞壁徹底破碎的同時(shí)也能將核酸、多糖等大分子干擾物質(zhì)剪切成小片段,優(yōu)化的 TCA/丙酮沉淀法則具有進(jìn)一步除糖、有效降低次生代謝物質(zhì)干擾和減少蛋白降解的優(yōu)點(diǎn),因此,兩者結(jié)合能使樣品除雜更徹底,雙向電泳效果更好.

2.2 園參不同部位蛋白提取量的分析比較

本實(shí)驗(yàn)采用Bradford法對(duì)提取得到的園參根不同部位蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定,隨后對(duì)其蛋白提取量進(jìn)行了比較分析,結(jié)果見(jiàn)表1.表1表明,4部位中須根蛋白提取量明顯高于其他3部位,達(dá)到27.0±0.11 mg/g鮮重,蘆頭（14.7±0.09 mg/g鮮重）和表皮（12.8±0.12 mg/g鮮重）次之,主根（10.6±0.08 mg/g鮮重）最低,僅為蘆頭蛋白提取量的39.3%.所以,僅從蛋白提取量方面也能看出4部位存在著明顯的區(qū)別,提示4部位之間藥理學(xué)成分合成量與成分之間的區(qū)別,可做為4部位質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒定與評(píng)價(jià)的潛在指標(biāo).

表1 園參不同部位蛋白提取量Tab.1 Protein yield of different parts of ginseng

2.3 園參不同部位蛋白SDS-PAGE圖譜的分析比較

SDS-PA GE電泳圖譜如圖1所示,可以看出,4部位SDS-PAGE圖譜中均存在3條較高豐度的帶,其灰度占總條帶灰度的95%以上,這將對(duì)后續(xù)的2-DE圖譜的獲得帶來(lái)很大困難,造成高豐度蛋白區(qū)域?qū)Φ拓S度蛋白的掩蓋,以及低豐度蛋白由于過(guò)低豐度造成蛋白點(diǎn)在低豐區(qū)域無(wú)法顯現(xiàn),為此我們摸索了不同細(xì)胞破碎方法和裂解液配方的有效組合,確定了最佳的適合低豐度蛋白提取的方法（結(jié)果未顯現(xiàn)）.比較4部位 SDS-PAGE圖譜可以看出,在20 100～31 000區(qū)域,蘆頭與其他3部位存在2條豐度明顯不同的條帶,在66 200附近存在1條豐度明顯低于其他3部位的條帶,且在31 000～66 200區(qū)域之間的低豐度蛋白條帶數(shù)目明顯多于其他3部位.表皮的66 200以上區(qū)域條帶明顯少于蘆頭和須根,但多于主根,且在31 000～66 200低豐度蛋白區(qū)域條帶的豐度要稍高于其他3部位.須根在20 100～31 000區(qū)域只存在2條高豐度蛋白,且豐度明顯高于蘆頭,稍高于表皮,并且在2條高豐度度條帶下方較其他3部位明顯少1條豐度明顯的條帶.而主根在66 200以上區(qū)域與其他3部位相比出現(xiàn)明顯條帶空白.通過(guò)以上比較分析說(shuō)明,園不同部位僅從SDS-PAGE圖譜看就存在較大區(qū)別,說(shuō)明其蛋白組成有著較大的差異,可能會(huì)對(duì)藥效成分的合成產(chǎn)生影響,可做為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)與鑒定的參考.

圖1 園參不同部位的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE pattern of different parts of ginseng root

2.4 園參不同部位2-DE圖譜的比較分析

圖2所示為經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的園參根不同部位蛋白2-DE圖譜.據(jù)軟件分析可知,園參主根蛋白點(diǎn)約有90%涵蓋于須根蛋白點(diǎn)之中.文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)稱(chēng)人參須根比主根功效好,是因?yàn)閰㈨毢藚⒃磉暗牧渴侵鞲?倍多[22].而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明,園參主根中的蛋白點(diǎn)也遠(yuǎn)少于須根,僅有須根蛋白點(diǎn)的三分之二.因此,園參須根比主根功效好,是否不僅與人參皂甙含量有關(guān),還與人參蛋白有關(guān);或者由于所含的園參蛋白不同導(dǎo)致其皂苷含量不同,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明;而園參表皮也有90%以上的蛋白點(diǎn)涵蓋于須根蛋白點(diǎn)之中,這可能是由于細(xì)長(zhǎng)的參須肉少皮多,表皮的面積占了多數(shù)所致.據(jù)《本草便讀》記載,人參,須則橫行支絡(luò),補(bǔ)而下行;蘆堪嘔吐虛痰,苦能上達(dá).而現(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)表明人參蘆頭并沒(méi)有嘔吐之副作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),園參蘆頭和須根在蛋白組成上僅有一些差別（如圖3和圖4所示,且在蘆頭蛋白圖譜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的點(diǎn) RH,其分子量在25 000～20 000之間,pI偏堿性,至于這些差異點(diǎn)是否與蘆頭嘔吐功效相關(guān),還需進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.另外,文獻(xiàn)已報(bào)導(dǎo)高麗參每個(gè)部位及西洋參的主根中都存在P1-P6 6個(gè)點(diǎn),且這些點(diǎn)可以被很好地分離.其pI大約在5.1～6.1,分子量在21 000～40 000之間[9].在園參的每個(gè)部位也同樣發(fā)現(xiàn)了這6個(gè)點(diǎn).高麗參每個(gè)部位及西洋參的主根中也存在C1-C3 3個(gè)點(diǎn),其pI大約在4.28～4.44,分子量約為18 000.園參中在這3個(gè)共同點(diǎn)的位置上發(fā)現(xiàn)了蛋白點(diǎn)團(tuán),園參不同部位還發(fā)現(xiàn)了一些共同的蛋白點(diǎn)和蛋白團(tuán),分子量在15 000～25 000之間,已標(biāo)出13個(gè)點(diǎn),如圖中白色粗線圓圈所示.另外,在主根圖譜中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)特異點(diǎn)MR1和MR2,它們的分子量在25 000～20 000之間,pI偏酸性,大約為3.0.蘆頭圖譜中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異點(diǎn) RH,其分子量在25 000～20 000之間,pI偏堿性,大約為8.0.表皮中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異點(diǎn)RS,其分子量大小約為14 400,pI偏酸性,大約為5.5.在須根中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異點(diǎn)群 RXG（包括豐度明顯的1個(gè)點(diǎn)和豐度偏小的2個(gè)點(diǎn)）,35 000左右,pI偏堿性,大約為8.5.以上這些蛋白點(diǎn)的異同可對(duì)不同參種和園參不同部位的質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒定提供參考.

圖2 園參不同部位的2-DE圖譜Fig.2 The 2-DE patterns of different parts of ginseng root

對(duì)比4部位2-DE圖譜,在一些區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了明顯的蛋白表達(dá)發(fā)生變化的區(qū)域,列舉如圖3和圖4所示:圖3為分子量在97 400～66 200,等電點(diǎn)在4.5～5.5的一段蛋白區(qū)域,園參各部位在此處的蛋白點(diǎn)模式和蛋白濃度各不相同（箭頭處標(biāo)示）.須根和蘆頭在此處各有兩個(gè)明顯的點(diǎn),但須根點(diǎn)的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蘆頭.表皮和主根在此處各有一個(gè)明顯的點(diǎn),但兩者的蛋白濃度也存在很大差別.圖4所示為園參各部位蛋白在偏堿性區(qū)域的明顯不同,它們?yōu)榉肿恿吭?6 200～20 100之間的一組蛋白.以上區(qū)域蛋白表達(dá)豐度的變化可進(jìn)一步說(shuō)明園參4部位在蛋白表達(dá)譜上存在明顯差異,可能會(huì)對(duì)藥效成分的合成產(chǎn)生影響,造成4部位藥效的差異,可做為園參不同部位質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒定的標(biāo)準(zhǔn).

圖3 不同部位人參蛋白蛋白表達(dá)差異點(diǎn)（區(qū)域Ⅰ）Fig.3 Different protein sports of the ginseng different parts（RegionⅠ）

圖4 園參不同部位蛋白蛋白表達(dá)差異點(diǎn)（區(qū)域Ⅱ）Fig.4 Different protein sports of the ginseng different parts（RegionⅡ）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)園參不同部位蛋白提取量、SDS-PAGE和2-DE圖譜的比較,發(fā)現(xiàn)了園參主根、須根、表皮和蘆頭之間的共性及差異,可以為園參內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo),為各部位的鑒定提供方法指導(dǎo),也將為其它中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究提供新思路.同時(shí),后續(xù)的質(zhì)譜鑒定工作也在進(jìn)行中,可為園參藥用機(jī)制的探討打下基礎(chǔ),推進(jìn)我國(guó)人參產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展.

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Abstract:This research aimed at establishing the 2-DE maps of ginseng rhizome,main root,lateral root and skin respectively,and comparing the differentially expressed proteins of different parts of ginseng.By the optimized TCA/acetone extraction method and the ultrasonication technology,four parts 2-DE maps of ginseng were obtained,and 13 spots were found in all parts of ginseng.Meanwhile,two special spots were found only in the main root,and one special spot in the rhizome,one special spot in the skin and one special spot group（three spots）respectively.In addition,two areas of differentially expressed proteins were also found in the 2-DE maps.These all provide the theoretical basis for the establishment of internal quality evaluation and identification for ginseng at the protein level,which could enrich the quality evaluation standard system.

Key words:different parts of ginseng;Two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）;quality evaluation standards

Two-dimensional electrophoresis analysis for different parts of Panax ginsengC.A.Meyer root

SUN Liwei1,MA Pengtao1,2,MA Rui2,L EI Xiujuan2,CHEN Xuenan1,QI Chao2
（1.Life Science Research Center,Beihua University,Jilin 132031;2.College of Life Science,Huazhong Normal University,Wuhan 430070）

Q946

A

1000-1190（2010）04-0639-05

2010-06-10.

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2007BAI38B02）;吉林市科技發(fā)展計(jì)劃（200813）.

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