PI3KI/Akt1在輻射誘導的乳腺癌細胞自噬發生中表達調控及作用機制

高 琳,劉曉冬,孔德娟,馬淑梅*

(1.吉林大學公共衛生學院衛生部放射生物學重點實驗室,吉林長春130021;2.中國科學院深圳先進技術研究院,廣東深圳518031)

自噬(autophagy)是細胞通過溶酶體來降解和消化自身受損、衰老以及喪失功能的蛋白、細胞器和部分細胞質等生物大分子的過程。自噬過程是真核細胞特有的行為,為細胞的再生與修復提供原料,實現細胞的再循環和再利用[1]。有文獻報道,在人類乳腺癌細胞株MCF-7中電離輻射照射可引起自噬泡的出現,提示輻射可誘導自噬[2]。電離輻射對細胞的生物學效應,主要是改變細胞內腫瘤基因或腫瘤抑制基因的表達,從而來調控照射后由相應基因表達的細胞內外信號轉導通路的變化。PI3KI/Akt1是一條生長因子信號轉導通路,參與細胞代謝、生長、死亡、惡變等腫瘤的發生發展。早期研究PI3KI/Akt1通路是其基于細胞凋亡的基礎上研究的[3],但有關輻射誘導的乳腺癌自噬性細胞死亡過程中是否有PI3KI/Akt1參與,尚未見報道。本研究在乳腺癌細胞中建立Akt1沉默與過表達模型,檢測自噬相關基因MAPLC3B的表達,以研究自噬發生中PI3KI/Akt1通路的變化及可能的作用機制,為尋求腫瘤治療新靶點提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 Trizol試劑、R T-PCR試劑盒、SYBR○RPremix Ex Taq TM(Perfect Real Time)試劑盒等購于大連寶生物公司;兔抗beclin1、鼠抗GapdH、增強化學發光法(ECL)發光試劑盒等均購自美國Santa Cruz公司;Lipofectamine TM2000脂質體購于美國Invitrogen公司;儀器:美國 Bio-Rad電泳儀,美國PE公司TC-1 PCR擴增儀,美國Stratagene Mx3000 PCR儀。

1.2 細胞培養與照射 人類乳腺癌細胞株(MCF-7)由本實驗室保存。使用10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,37°C、5%CO2培養箱中培養,0.25%胰酶消化傳代。(1)mRNA檢測:正常MCF-7與模型組分別生長至80%后,將其分為假照組和照射組,假照組根據照射后收獲細胞時間分為4、8、16和32 h組;根據照射劑量不同分為2、4、8和12 Gy組。(2)蛋白檢測:分為假照組與照射組,假照組根據提取蛋白時間分為0.5、1、2、4、8、24 h;根據照射劑量分為 2、4、8 和 12 Gy。正常細胞組照射采用國產X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機,濾板0.5 mmCu+1.0 mmAl。單次照射靶皮距500 mm,吸收劑量率0.287 Gy/min;模型細胞組照射條件為單次照射靶皮距600 mm,吸收劑量率0.41 Gy/min。

1.3 細胞轉染

磷酸鈣共沉淀法 MCF-7在1640完全培養液中常規培養。實驗分組:空白對照組,不給予任何干預措施;空載體轉染組 psuper retro,轉染 體系如下:Ampho Pack 10 μ g、Akt si RNA10 μ g 、2 mol/l CaCl231 μ l、ddH2O 補 至 250 μ l 和 2 ×HBS 250 μ l?；旌弦夯靹蛟谝幎〞r間內轉染MCF-7細胞;Akt1 siRNA轉染組,方法同空載體轉染組。轉染48 h后藥物濃度為0.9 μ g/ml puromycin篩選至陽性克隆出現。

1.4 RT-PCR

1.4.1 細胞總RNA提取。

1.4.2 按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應操作。

1.4.3 引物 Akt1(NM-001014432.1)序列如下。

上游引物 5′-CTGAGATTGTGTCAGCCCTGGA-3′,下游引 物5′-CACAGCCCGAAGTCTGTGATCTTA-3′;MAP1LC3B(NM-022818.4)引物:上游引物 5′-CCTAGAAGGCGCTTACAGCT-3′,下游 引 物 5′-GGGACAATTTCATCCCGAAC-3′;GAPDH(NM-002046.3)引物:上游引物 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.5 實時熒光定量RT-PCR

采用大連寶生物公司的SYBR○RPremix Ex Taq TM(Perfect Real Time)試劑盒。

PCR擴增程序 在美國Stratagene Mx3000 PCR儀中進行。反應條件如下,95℃預變性5 s;95℃變性5 s,60℃退火20 s,共40個循環。實驗設計是按照△△Ct解析法來進行目的基因與管家基因的相對定量。

1.6 免疫印跡

Western blot蛋白煮沸5 min進行變性,SDS-PAGE電泳。上樣蛋白量為60μ g,電壓分別為 90和100 V;電泳后濕式轉印NC膜上(100 V 60 min);5%脫脂奶粉封閉1 h,加1∶250稀釋的一抗于4℃搖床過夜;TBS洗膜3次;加1∶1 000稀釋二抗反應90 min,TBS洗膜3次,ECL顯色并記錄結果。

1.7 統計學處理 beclin 1基因與蛋白檢測結果采用Image J軟件進行電泳條帶灰度分析;MAP1LC3B檢測結果采用SPSS 17.0統計軟件進行方差齊性檢驗,以表示,各組與假照組之間采用單因素方差分析;兩兩比較則用Dunnet t檢驗,P＜0.05(或＜0.01)為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 照射后MCF-7細胞中的Akt1基因表達的變化

首先,采用實時定量PCR方法檢測Akt1的劑量-效應關系,即在不同時間點檢測MAP1LC3B隨劑量變化的規律。從圖1a可以看出,照射后4、8 h量效結果表明,Akt1表達分別在2、4、8 Gy區間內明顯呈劑量依賴下降變化,12 Gy有所回升但仍低于假照組,差異顯著(F=210.684,555.937,P＜0.01);16 h量效表明,Akt1表達分別在2、4、8 Gy區間劑量依賴下降,12 Gy有所回升仍低于假照組(F=63.766,P＜0.01);32 h量效結果表明,Akt1表達明顯呈劑量依賴下降變化,4、8、12 Gy有顯著性差異(F=45.461 P＜0.05)。

在時間效應研究中,Akt1的變化如圖1b。MCF-7細胞照射2 Gy后16h表達降至最低,無顯著性差異;4、8、12Gy時程研究Akt1表達量均于8 h降至最低,差異顯著(F=73.059,275.927,152.760,P＜0.05)。照射后Akt1基因總體變化均低于假照組。

2.2 照射后MCF-7細胞中的Akt1蛋白表達的變化

采用Western-blot檢測方法beclin1蛋白表達水平的變化,結果如圖2。2 Gy時效研究表明,照射后2 h Akt1蛋白表達即有明顯下降趨勢(與假照組相比下降70%),24 h達至最低值(與假照組相比下降87.1%);4 Gy時效研究表明,照射后0.5 h Akt1蛋白表達明顯下降(與假照組相比下降87.7%),8 h達至最低值(與假照組相比下降94%),24 h有所回落但仍低于假照組;8 Gy時效研究表明,照射后Akt1蛋白表達在0.5-4 h區間內呈時間依賴下降趨勢,4 h達至最低值(與假照組相比下降67.3%),8 h-24 h有所回升,但仍低于假照組。

圖1 MCF-7細胞照射后Akt的劑量-效應變化(a)與時間-效應變化(b)

2.3 MCF-7細胞中的Akt1沉默細胞模型的建立

我們利用磷酸鈣沉淀法將表達載體的si R NA導入包裝細胞293T,收集假病毒顆粒后直接感染靶細胞MCF-7,采用Western blot方法檢測Akt基因的表達,結果如圖 3所示,Akt1 siRNA組與對照組相比,模型組Akt1基因表達明顯減少,表明發揮了基因沉默的效果。

圖3 MCF-7細胞AKT沉默模型建立模型蛋白表達

2.4 Akt1 siRNA細胞模型中照射對自噬發生的影響

Akt1 siRNA沉默細胞模型建立后,我們采用實時定量PCR檢測其中MAP1LC3B表達量的變化。如圖4a,4 h量效表明,MAP1LC3B表達上升但并無顯著性變化;8 h量效表明,MAP1LC3B表達呈劑量依賴上升變化,8、12 Gy有統計學差異(F=18.181,P＜0.05),于12Gy達至最大值;16 h與32 h量效表明,MAP1LC3B在2-4Gy區間內呈劑量依賴上升變化,8 Gy有所回落,12 Gy上升至最大值,均有顯著性差異(F=35.057,P＜0.01;F=21.056,P＜0.05)。

其次,我們檢測了其時間效應關系,結果如圖4b。2 Gy與4Gy時效表明,4、8 h并無顯著性差異,但MAP1LC3B表達均于16 h與32 h時間點開始上升,差異顯著(F=19.447,28.405,P＜0.01);8 Gy時效表明,MAP1LC3B表達呈劑量依賴上升變化16 h與32h差異顯著(F=7.169,P＜0.05);12Gy時效表明,8、16、32 h MAP1LC3B表達呈劑量依賴上升變化,有顯著性差異,于32 h達至最大值(F=35.580,P＜0.05)。

3 討論

放射治療是治療乳腺癌的主要組成部分,是局部治療手段之一。但目前常用的放療設施較難達到完全殺滅腫瘤的目的,因此,放射治療與特異性靶點基因治療聯合作用來殺死腫瘤就成為一個研究方向。

圖4 照射后Akt1 siRNA沉默細胞模型中MAP1LC3B的劑量-效應變化(a)與時間-效應變化(b)

自噬是細胞通過溶酶體包裹自身衰老或死亡的蛋白或細胞器而進行的自我存活的機制,但持續的自體吞噬會導致程序性細胞死亡[4]。LC3蛋白是自噬標記物,位于自噬體和自噬溶酶體膜上,通過檢測細胞內MAP1LC3B的表達量的變化,可以判斷自噬是被誘導還是被抑制。

磷脂酰肌醇3-激酶I(phosphatidylinositol 3-kinase I,PI3KI)是調節細胞增殖和細胞周期的早期信號分子,具有胰島素的功能,在各類癌癥的發生、發展、侵襲及轉移過程中具有重要的作用。PI3KI由具有調節功能的亞單位p85和具有催化功能的亞單位p110異二聚體組成[5,6,7],這種結構由蛋白酪氨酸激酶活性受體和G蛋白偶聯受體所激活?；罨疨I3K下游信號分子Akt、mTOR關系密切,Akt是一個 PI3KI下游重要的靶激酶,具有絲-蘇氨酸激酶活性Akt的活化可以調節細胞內蛋白的各項功能,包括促進細胞轉錄與增殖、加強細胞的能動性/粘附性、細胞周期進程加速、加速腫瘤血管生成使細胞發生惡性轉化。

研究表明,無血清饑餓方法可以誘發細胞自噬,同時也可以引起細胞周期阻滯;抑制PI3KI/Akt通路可抑制細胞周期運行,并且細胞周期受抑時往往可以觀察到自噬的發生[8]。電離輻射作用后Bax/Bak(-/-)MEF細胞的PI3K/Akt/mTOR信號減弱,ATG5、ATG12、beclin1等自噬相關基因表達增強,經mTOR抑制劑Rad001治療后,自噬進一步增強,MEF細胞則發生自噬性死亡[9]。X線照射可以促使MCF-7細胞發生自噬[10],本研究中發現正常組MCF-7照射后Akt1基因與蛋白總體表達均低于假照組,這說明電離輻射在一定時間內能夠有效的抑制Akt1的表達,阻斷PI3KI/Akt1通路。

為了進一步研究MCF-7是否由于輻射抑制了PI3KI/Akt1通路而發生自噬,探討PI3KI/Akt1與自噬之間的作用機制,我們在MCF-7細胞株中建立了Akt沉默的細胞模型。首先,Akt1 siRNA模型照射組量效研究表明,MAP1LC3B表達在8、16、32 h均有不同程度升高變化,12 Gy達至最大值。2、4、8 Gy時間效應表明,MAP1LC3B表達在16 h、32 h上升變化顯著;12 Gy時效表明,8、16、32 h MAP1LC3B表達呈劑量依賴上升變化,這個結果說明運用RNA干擾的手段可以有效的抑制Akt1的表達,電離輻射誘導的基礎上MAP1LC3B表達均有不同程度的升高,表明電離輻射作用聯合Akt1基因沉默后自噬發生更加顯著。

目前,PI3KI/Akt1信號轉導通路在腫瘤的發生、發展、治療中成為熱點研究目標,有關它的報道多數仍以誘導腫瘤細胞凋亡為主。電離輻射誘導的腫瘤細胞自噬性死亡中PI3KI/Akt1是如何轉導調控的尚未見報道。因此,本研究通過建立基因沉默及過表達模型,進一步探討該通路與自噬之間的作用機制,針對該信號轉導通路尋找新的抗腫瘤藥物對于腫瘤的治療將具有十分重要的意義。

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[10]高 琳,劉曉冬,馬淑梅.beclin 1在輻射誘導的乳腺癌細胞自噬發生中表達的變化.中華放射醫學與防護雜志,2010,30(2):17.