微小RNA對心肌細胞C反應蛋白功能水平的調節

郭威早,佟 倩,曹立新,李 琳

(1.北京大學航天中心醫院高干二科,北京100049;2.吉林大學第一醫院心內科;3.安徽省六安市婦幼保健院檢驗科;4.中國醫學科學院阜外心血管病醫院心內科)

微小RNA(microRNA,簡稱miRNA)是人和其他生物體中內源性的短鏈RNA分子,長度為22核苷酸左右,其通過與相關的信使RNA(mRNA)結合抑制其翻譯或誘發其降解[1]。研究顯示,人類基因的30%受miRNA調節,此外miRNA的調節能力極強,單一的miRNA可以調控多達100-200個基因[2]。大量的研究證明,miRNA與心血管具有非常緊密的聯系,這種聯系的表現極為廣泛,包括心臟的發育、損傷、修復,也包括各種心血管疾病,miRNA業已成為冠心病等心血管疾病分子病理學的研究熱點[3]。

C反應蛋白(C-reactive protein,簡稱CRP)是心血管疾病中最具代表性的信號分子之一,也是現代心血管疾病研究的焦點之一。離體和在體的研究顯示,CRP能夠識別宿主體內特定的外來病源以及受損的細胞,與血液中的體液及細胞效應機制相互作用,從而啟動對病源和受損細胞的清除[4]。由此可見,CRP既具有識別功能,又兼備效應能力,其重要性非同一般。本研究將微小RNA和C反應蛋白結合起來,探討miRNA對CRP的調節。

1 材料與方法

1.1 大鼠心肌細胞培養 大鼠心肌細胞H9c2(2-1)由美國ATCC公司購買,獲得細胞株之后,采用 DMEM培養基加10%胎牛血清,在 5%CO2,37℃條件下培養。一輪培養 3天,然后按1∶2-4的比例分盤繼續培養,細胞脫壁收集采用0.25%(重量/體積)胰蛋白酶合并0.53 mM EDTA溶液處理10分鐘。

1.2 調控CRP之miRNA的選擇 miRNA與調控靶基因之間不存在精確的對應關系,一個miRNA可以調控數十個甚至更多的基因,同時,一個基因也可以被數十個乃至更多的miRNA調控。因此,選擇一個基因的調控miRNA需要多層次,多角度的分析。在本研究中,我們首先根據國際通行的理論預測方法[5]對大鼠C反應蛋白基因3'端非轉錄區(UTR)進行推測,以“種子區”(seed)完全匹配為篩選標準,獲得21個候選miRNA,對大量的既往研究報道進行了對比分析后,最后鎖定了miR-132。miR-132除了根據理論推測調控CRP之外,研究顯示,其在機體應激反應和白細胞介素-8(il-8)的調節中具有重要作用[6]。應激反應和il-8均與心血管疾病有密切的聯系,由此進一步佐證了miR-132極有可能介入心血管疾病的調節。

1.3 miR-132的增強和抑制 增強劑和抑制劑均從美國Ambion公司(現為美國ABI公司所屬)。PremiR miRNA前體為合成的雙鏈RNA分子(針對miR-132的產品號為PM10166),因模擬自然產生的miR-132的功能而產生增強效應;Anti-miR miRNA抑制劑為化學修飾的單鏈核酸(針對miR-132的產品號為AM10166),可以特異地結合miRNA而產生抑制效應。此外Pre-miR miRNA前體分子陰性對照1號(產品號:AM17110)和Anti-miR miRNA抑制劑陰性對照1號(產品號:AM17010)分別作為增強劑和抑制劑的陰性對照。

1.4 細胞轉染 為了將miR-132增強劑、抑制劑及其相應陰性對照導入培養的H9c2(2-1)大鼠心肌細胞,實驗采用美國Neuromics公司iFect試劑盒,操作按照產品說明書進行。預實驗采用了4個濃度,分別為10、20、30及40 nmol/L,正式實驗按最小有效劑量原則(盡可能減少轉染試劑對細胞的毒副作用)采用20 nmol/L。細胞在轉染后狀態繼續培養48 h。

1.5 蛋白免疫印跡雜交 通過1000 g,10 min離心收集培養細胞。將細胞沉淀重懸于1 ml冰冷的裂解緩沖液,轉移至2.0 ml Eppendorf離心管中。裂解緩沖液包括:20 mM Tris-HCl(pH7.5),1 mM EDTA,1 mM EGTA,2.5 mM焦磷酸鈉,1%Triton X-100,150 mM氯化鈉,1 mM β-磷酸甘油。以下成分在使用前加入:5 mM二硫蘇糖醇,1%磷酸酶抑制劑Cocktail I,1%磷酸酶抑制劑Cocktail II,10%磷酸酶抑制劑Cocktail(磷酸酶抑制劑購自Sigma公司)。樣本通過Virtis超聲細胞粉碎儀進行超聲剪切(設置2.0,處理1 s×10次),然后,樣本在14 000 g離心 5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進行。免疫印跡用處在線性區間的蛋白量進行。等量的蛋白加入到8-16%SDS-PAGE進行電泳分離然后電轉移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水,0.1%吐溫-20,5%脫脂牛奶。CRP抗體(美國Abcam公司)根據制造者的建議稀釋并根據初始測試調整,正式實驗中采用1∶200的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯的抗兔抗體。β-肌動蛋白抗體(美國Cell Signaling公司)用作上樣對照。免疫復合物用ECL加強型試劑盒(美國Amersham公司)探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene G:BOX凝膠建檔及分析系統(英國Syngene公司)進行。

1.6 統計分析

統計檢驗用SPSS 11.5版進行。資料收集,一般統計計算(均值、標準差、標準誤等)以及統計作圖采用微軟公司MS-Excel(version 2000)。

2 結果

2.1 大鼠心肌細胞H9c2(2-1)培養 在本研究所設定的培養條件下,大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)生長狀況正常,無異常分化,形態符合大鼠細胞的一般組織學特征(見圖1)。

圖1 培養中的大鼠心肌細胞H9c2(2-1)(倒置顯微鏡 100×觀察)

2.2 miR-132的增強和抑制對CRP蛋白表達水平的影響 培養中的大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)在運用增強劑Pre-miR-132處理48 h后,CRP蛋白水平與陰性對照相比,出現了明顯的下降(t-檢驗,P=0.013 21)。與此同時,大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)在運用抑制劑Anti-miR-132處理48小時后,CRP蛋白水平與陰性對照相比,出現了明顯的上升(t-檢驗,P=0.012 40)。作為本實驗蛋白印跡雜交的上樣內參照,β-肌動蛋白的水平沒有顯著差異。miR-132的增強和抑制實驗采用6孔細胞培養板進行,每對處理-對照均在同一細胞培養板上進行,確保培養和處理條件的完全一致。miR-132增強和抑制實驗分別進行了6對比較(n=6)。miR-132的增強和抑制結果詳情參見圖2。

圖2 miR-132增強劑和抑制劑對CRP蛋白質水平的影響

3 討論

在冠心病的病理學說中,C反應蛋白居于重要的核心地位[7],國內外均對這一標志性蛋白分子進行了大量的研究。迄今為止的研究絕大多數CRP本身的量化測定以及與疾病的相關,很少涉及CRP背后的分子調控機制。心血管病具有非常復雜的背景,在CRP的背后存在眾多復雜的因素及這些因素之間的相互作用,這種復雜的背景在很大程度上阻礙了對CRP分子調節機制的研究。近年來關于miRNA認識的深入為心血管疾病的分子機制研究提供了新的途徑,也為重新認識CRP的基因調控提供了新的手段。

本研究以大鼠心肌細胞為研究對象,在具有潛在調節功能的miRNA功能增強和抑制的條件下觀察CRP蛋白的水平,旨在建立miRNA與CRP基因功能水平二者之間的關系。本研究經過系列的分析篩選,通過理論推測和參考研究報道選擇了miR-132。研究顯示,miR-132可以調節應激反應,并可以調節細胞因子白細胞介素-8的水平[6]。值得關注的是,應激被大量的研究證實為冠心病的危險因素[8,9],而IL-8與冠心病的聯系也具有明確的研究支持[10]。

我們的研究觀察在很大程度上證實了理論上的預計。采用miR-132增強處理可以顯著抑制心肌細胞CRP蛋白水平,說明miR-132對CRP基因的功能水平具有抑制調節功能。與此相對應,采用miR-132抑制處理可以顯著提高心肌細胞CRP蛋白水平,說明miR-132功能部分或全部喪失的情況下,CRP的基因功能水平可以大幅度的提高。研究提示,在心血管疾病的分子病理學方面,miRNA是一個不可忽視的重要調控因素。

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