靶向EZH2基因的shRNA真核表達載體的構建及鑒定

盧 績,陳岐輝,許 寧,王春喜,王曉慶,侯宇川,汪 巖

(吉林大學第一醫(yī)院泌尿外科,吉林長春130021)

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)基因是果蠅zeste基因增強子的人類同源基因,是Polycomb group(PcG)基因家族的重要成員之一。PcG蛋白控制著細胞的轉錄記憶系統(tǒng),抑制轉錄,維持同源異型基因的失活狀態(tài)[1],并參與細胞增殖的調控,許多PcG復合物已被證實在脊椎動物中起原癌基因或腫瘤抑制基因的作用[2]。本研究通過構建靶向EZH2基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達載體,擬通過RNAi技術抑制EZH2基因的表達,從而為在基因水平探討EZH2基因在腫瘤細胞中所起的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由吉林大學公共衛(wèi)生學院放射生物教研室保存并提供。真核表達載體pGenesil-2質粒購自武漢市晶賽生物工程技術有限公司。限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ及T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司。小量質粒提取試劑盒購自中鼎公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向EZH2基因的shRNA序列的設計 根據Genebank中EZH2基因的mRNA序列(Genbank accession no.NM-004456,NM-152998),采用Ambion 公司的網上設計軟件(http://www.ambion.com),并參考shRNA的設計原則[3],設計兩段靶向EZH2 mRNA的shRNA序列及一段不針對任何基因的陰性對照shRNA序列,并通過BLAST對所選擇的靶序列進行同源分析,排除shRNA非特異性抑制其它基因片段的可能,最終確定shRNA序列。shRNA序列莖環(huán)結構為 9個與 EZH2基因不互補的非同源堿基(TTCAAGACG),即 Loop結構,末端終止子為TTTTTT,在合成的DNA片段末端設計SalⅠ酶切位點,并于整個shRNA結構兩側設計BamHI和HindⅢ酶切位點。設計的具有發(fā)夾結構的靶向EZH2基因的shRNA干擾片段序列如下:

以上DNA寡核苷酸單鏈均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 編碼shRNA序列的單鏈寡核苷酸片段的退火連接。pGenesil-2載體的線性化(BamHⅠ+HindⅢ雙酶切)。退火產物與線性化pGenesil-2質粒表達載體的連接。感受態(tài)細胞的制備采用CaCl2法。

1.2.3 連接產物轉化感受態(tài)細胞 各取5 μ l過夜產物分別加入200 μ l感受態(tài)細胞DH5α中混勻,冰浴30 min,42℃水浴熱休克90 s,迅速冰浴冷卻3 min,再向其中加入800 μ l LB培養(yǎng)基,37℃搖床溫育45 min使細菌復蘇并表達質粒的Kana抗性標記基因。將菌液分別涂布于含Kana(終濃度30 μ g/ml)的 LB平板上,同時設立兩個對照,即用未轉化質粒的感受態(tài)細胞DH5α分別涂布與含同樣濃度Kana的LB平板和不含抗生素的LB平板上,均放置于37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。從含Kana的LB平板上各挑取3個單克隆菌落接種于3 ml含Kana抗性(終濃度30 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫搖床(250 rpm)培養(yǎng)過夜。

1.2.4 重組質粒的提取及酶切鑒定 收集上述培養(yǎng)菌液,用小提試劑盒(中鼎公司)參照質粒提取試劑盒提取步驟小量提取質粒。將提取得到的質粒用SalⅠ酶切 ,取質粒 DNA 1 μ l,10 ×H Buffer 1 μ l,SalⅠ1 μ l,去離子水7 μ l混勻,共 10 μ l反應體系,37℃水浴反應 3 h,取5 μ l反應產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.5 測序鑒定 為進一步驗證重組質粒構建的準確性,經酶切鑒定后,將連接正確的重組質粒菌液送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

2 結果

2.1 shRNA真核表達載體構建模式

重組質粒的結構圖見圖1。

2.2 pGenesil-2載體的線性化處理結果

pGenesil-2載體的線性化處理結果見圖2。

2.3 重組質粒的酶切鑒定

重組質粒酶切電泳圖見圖3。在插入的目的基因片段里,我們設計了一個SalⅠ的酶切位點,插入在質粒pGenesil-2多克隆位點的BamHⅠ和HindⅢ之間,如果插入正確,應用SalⅠ酶切時,可切出一條約400 bp的DNA片段。從圖中可以看出,pGenesil-2-EZH2-1,pGenesil-2-EZH2-2和陰性對照質粒都能夠被SalⅠ酶切出一條約400 bp的小片段,而對應未進行酶切的樣品則沒有小片段,可以證明所設計的shRNA干擾片段確已插入到pGenesil-2質粒載體中。

2.4 重組質粒的測序分析

測序分析顯示,在pGenesil-2-EZH2-1中,shRNA重組質粒終止信號6個T堿基可能因公司合成問題為5個T堿基,但根據RNAi原理,起關鍵作用的是與靶序列互補的siRNA反義鏈堿基,而5個T堿基亦能起到終止轉錄作用,因此該重組質粒質粒可以使用。其余重組質粒編碼序列插入位置正確,無基因突變,與設計完全一致。

3 討論

EZH2基因定位于人類染色體7q35,作為PcG蛋白家族的重要成員,其在維持同源盒基因(Hox)的轉錄抑制狀態(tài)方面起關鍵作用,其中一個重要表現(xiàn)就是參與細胞增殖。最早提出EZH2參與細胞增殖是來自于觀察到EZH2基因在增殖的外套淋巴細胞瘤細胞中優(yōu)勢表達,而在靜止的細胞中則相反[4]。隨后,陸續(xù)在前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中都發(fā)現(xiàn)有EZH2基因高表達,而在其對應正常組織中則不表達或僅少量表達[5-8]。我們也在對國人膀胱癌組織中的EZH2基因表達情況進行了研究,發(fā)現(xiàn)隨著膀胱癌分級及分期的提高,EZH2基因表達率上升,提示EZH2基因不僅可作為膀胱癌的一種新的癌基因和腫瘤標志物,其表達失調還可能與膀胱癌的惡性度和浸潤性相關[9]。

圖1 重組質粒結構示意圖

圖2 pGenesil-2載體的線性化處理后電泳圖

圖3 重組質粒酶切電泳圖

siRNA是一種短片段雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的mRNA為把目標降解特定的mRNA,因此在RNA干擾技術中,siRNA是關鍵。與抑制基因表達的傳統(tǒng)工具,如反義寡核苷酸和核酶等比較,siRNA沉默基因的效率高達數十到數千倍。但是,雖然siRNA分子比單鏈的反義寡核苷酸要穩(wěn)定,在體內仍會受到血漿中和細胞外液中核酸酶的降解,影響其長期的穩(wěn)定性。shRNA即短發(fā)夾RNA,是含siRNA的正義和反義鏈的一段序列,中間以7個或9個堿基以形成環(huán)狀,是siRNA的雙鏈配對。shRNA在細胞內表達后可被Dicer切割莖環(huán)而產生雙鏈siRNA。在這種情況下,攜帶靶向目的基因shRNA的載體就能夠供給細胞大量的siRNA,并能分配到子代細胞中去,發(fā)揮更持久的RNA干擾作用。本研究構建的靶向EZH2基因的shRNA真核表達載體使用U6啟動子啟動shRNA序列的轉錄,PolⅢ識別的終止信號終止轉錄,符合shRNA表達載體的設計要求。pGenesil-2載體的多克隆酶切位點中有一個SalⅠ酶切位點,我們在插入BamHⅠ和HindⅢ之間的shRNA片段中也設計了SalⅠ位點,這樣,當片段插入正確時,就能被SalⅠ酶切出1條約400 bp大小的片段,經過酶切鑒定分析,構建的重組質粒酶切片段與預期大小一致,經測序分析發(fā)現(xiàn),在pGenesil-2-EZH2-1中,shRNA重組質粒終止信號6個T堿基實際為5個T堿基,但5個T堿基亦能起到終止轉錄作用,而在RNA干擾中起關鍵作用的與靶序列互補的siRNA反義鏈堿基序列正確,證實構建成功。另外,本研究在構建重組質粒時采用了不含綠色熒光蛋白的pGenesil-2載體,在今后的RNA干擾實驗中可以方便通過流式細胞儀進行Annexin V/PI雙染進行細胞凋亡的檢測,避免了質粒本身所含熒光可能帶來的干擾。

[1]Cao R,Wang L,Wang H,et al.Role of histone H3 lysine 27methylation in Polycomb-group silencing[J].Science,2002,298(5595):1039.

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[4]Visser HP,Gunster MJ,Kluin-Nelemans HC,et al.The Polycomb group protein EZH2 is upregulated in proliferating,cultured human mantle cell lymphoma[J].Br J Haematol,2001,112(4):950.

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[9]盧 績,王曉慶,蘆志華,等.EZH2基因在膀胱移行細胞癌細胞株和癌組織標本中的表達及意義[J].中華泌尿外科雜志,2009,30(5):332.