枸杞多糖增強效應T細胞增殖和殺瘤活性機制的研究

王曉華，單鐵英，侯永超，楊書良

(1.河北工程大學醫學院 a生物學教研組；b人體解剖學與組織胚胎學教研組；c病理學教研室，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市第一醫院腫瘤內科)

以免疫治療為代表的腫瘤生物治療是重要的腫瘤輔助治療方法[1]。在腫瘤生物治療中應用增強抗腫瘤細胞活性的物質，是提高療效的有效途徑。研究表明許多中藥或其有效成分具有多方面的免疫調節活性，能夠增強免疫活性細胞的功能[2]。目前國內有關枸杞多糖可增強免疫系統的能力從而產生抗腫瘤作用方面的報道很多，但是其具體的機制尚不明確，本研究觀察了枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides，LBPs)在樹突狀細胞成熟及T細胞的激活、增殖和殺瘤過程中的作用。為進一步研究LBPs調節特異性免疫應答的機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮人外周血，購自北京市血庫。淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠。rhGM-CSF、rhIL-2和rhIL-4，購自德國R&D公司。尼龍毛購自FENWAL USA。鼠抗人MHC-Ⅱ、CD86、CD83，即用型二步法生物素檢測試劑盒(PV9000)、FITC標記的第II抗體工作液購自北京中山生物技術有限公司。枸杞多糖購自美國泛華公司。

1.2 方法

1.2.1 未成熟樹突狀細胞(Immature Dendritic Cell，imDC)的培養：取正常人新鮮外周血200ml，以淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞并培養2 h，取貼壁細胞即單核細胞，加入 10%胎牛血清、rhGMCSF1000 U/m l、rhIL-4 500 U/m l繼續培養 7天即為imDC。

1.2.2 腫瘤細胞全抗原致敏imDC并培養為成熟樹突狀細胞(Mature Dendritic Cell，mDC)：常規培養肝癌細胞株Bel-7402，收集處于對數生長期的細胞并反復凍融(-80℃/室溫)4次作為腫瘤細胞全抗原。將imDC調整細胞濃度至1×106個細胞/m l，加入腫瘤細胞全抗原0.2m l培養2天，即腫瘤細胞全抗原致敏的imDC。分為兩組：實驗組：加入終濃度100 μg/m lLBPs；對照組：加入等量的 RPMI-1640；兩組分別同時作用48h后。觀察DC的形態變化及其表面標志的表達。

1.2.3 T細胞的獲得：按上述獲得單核細胞的方法，收集非貼壁細胞即為淋巴細胞，將3×107/m l的淋巴細胞注入尼龍毛柱，靜置1 h。用培養液洗柱，洗下的即為T細胞，加入rhIL-2 500 U/m l培養待用。1.2.4 T細胞的激活和增殖：懸浮上述T細胞為2×105個/100μl，放入96孔板，作為反應細胞。mDCs作為刺激細胞。調整mDC濃度2×103個/孔、1×104個/孔、2×104個/孔分別與T細胞混合，分兩組 ：實驗組 ：加入終濃度 100 μg/m lLBPs；對照組 ：加入等量的RPMI-1640；用MTT法測各孔的OD值。

增值指數為：實驗組OD值-反應細胞對照組OD值-刺激細胞對照組OD值/反應細胞對照組OD值。

1.2.5 效應T細胞殺傷腫瘤細胞 將按上述方法獲得的兩組T細胞(T細胞+DC+LBPs、T 細胞+DC+

2.3 T細胞殺傷腫瘤細胞 通過MTT法檢測腫瘤細胞活力的影響，來表明腫瘤細胞的殺傷情況：在培養液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷肝癌細胞能力增強，而對MG-63細胞不能有效地殺傷(P＜0.05)。未經mDC刺激的T細胞作為對照，由于缺乏mDC的抗原呈遞和刺激作用，T細胞不具有特異性殺傷腫瘤細胞的能力(表3)。RPMI-1640)，新鮮分離的T細胞作為對照。三組作為效應細胞置96孔板中，分別以人肝癌細胞Bel-7402和人骨肉瘤細胞MG-63作為陽性和陰性靶細胞，效靶比為30：1。用MTT法測各孔的OD值。

T細胞殺傷活性：靶細胞對照組OD值-實驗組OD值-效應細胞OD值/靶細胞對照組OD值。

1.2.6 數據處理 所得數據經SPSS11.0軟件進行處理，結果采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 單核細胞在培養過程中，可見細胞體積逐漸增大，細胞形態逐漸由圓形變為逗點狀、蝌蚪狀、長梭形或不規則形，并向四周伸出不規則狀的突起。

免疫細胞化學檢測：imDC細胞表面MHC-Ⅱweak+、CD86weak+、CD83weak+。經 LBPs誘導培養2 d后的DC的表面標志及蛋白表達發生變化：MHCII+、CD86+、CD83+，陰性對照無陽性信號。而經RPMI-1640培養的mDC分子表達與培養前無明顯變化。對照組與實驗組培養的DC的分子表達圖像分析(表1)。

2.2 T細胞增殖實驗結果 通過MTT法檢測LBPs對T細胞活力的影響，來表明T細胞的增殖情況：培養液中LBPs有時DC激發T細胞增殖的能力進一步增強(P＜0.05)(表2)。且在此濃度范圍內隨著DCs濃度的增加T細胞的增殖率也增加。

表1 實驗組和對照組培養2天后的樹突狀細胞表面分子表達的圖像分析結果(ˉx±s)

表2 T細胞增殖率(ˉx±s，n=10)

表3 效應T細胞殺傷實驗(ˉx±s，n=10)

3 討論

枸杞多糖是傳統中藥材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成，具有廣譜防癌抗癌和調節免疫功能的作用[6]。

DC是一種重要的專職抗原提呈細胞，對啟動輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的免疫應答具有重要作[7-9]。imDC俘獲和處理外源性抗原后為mDC，通過主要組織相容性復合物(MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子來激活T細胞，啟動特異性免疫應答。實驗證明，DC的成熟狀態與其功能有關：imDC有較強的抗原攝取和加工能力，同時低表達MHC-II、CD86、CD83。mDC攝取抗原功能下降，但是MHCII、CD86、CD83分子高表達。這些分子正是與DC抗原提呈作用密切相關的分子，也是與DC對T細胞的激活作用密切相關的分子。我們發現DC經過LBPs刺激作用后，MHC-II、CD86、CD83的表達增高，同時混合淋巴細胞反應也證實，經LBPs培養后DC激活T細胞能力及T細胞增殖能力都增強。這些都說明LBPs誘導DC成熟，同時刺激T細胞增殖能力增強。

經肝癌細胞抗原致敏imDC并培養為mDC激活的T細胞能特異性的殺傷肝癌細胞，而培養液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷肝癌細胞的能力進一步增強。對MG-63細胞因為不能有效地識別所以不能殺傷。

有研究表明，適量的枸杞多糖能增加T細胞IL-2受體的表達量，枸杞多糖對T細胞活性的增強作用可能通過增加IL-2R的表達量協同IL-2對T細胞的刺激作用，提示枸杞多糖對T細胞活性的增強效應部分與促進IL-2R的表達有關[10]。研究發現枸杞多糖對免疫活性細胞無直接刺激作用，DC表面存在多糖受體，枸杞多糖可與DC表面存在的多糖受體結合[11]，啟動和活化DC使其分泌細胞活性因子，活化的DC及其釋放的活性因子的間接作用促進T細胞等免疫活性細胞的功能；同時，T細胞被IL-2等第一信號活化后也可表達多糖受體，與多糖類物質結合而產生協同效應。這些都表明在培養液中有LBPs存在時效應T細胞殺傷腫瘤細胞的能力增強。

本研究只是通過上述幾種實驗證明枸杞多糖能促進樹突狀細胞成熟和增強效應T細胞的增殖和殺傷腫瘤的活性。但其具體的分子生物學機制尚需進一步的研究。

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