酵母細胞破碎條件優化及高肽酶菌株篩選

李永霞，曾海英，秦禮康*

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

酵母細胞破碎條件優化及高肽酶菌株篩選

李永霞，曾海英，秦禮康*

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

為構建酵母細胞總肽酶活力的測定方法。采用單因素試驗和L9(34)正交試驗設計，以反應體系中游離氨基酸總量為肽酶活力指標，對酵母細胞破碎條件進行優化。結果表明：最佳破壁條件為：蝸牛酶添加量10mg/mL、超聲破碎功率500W、超聲時間8min、超聲時間間隔5s。在此條件下，對主要源于貴州特色發酵豆制品的61株酵母菌進行總肽酶活力測定，獲得產高肽酶酵母菌4株，即WCF-5、XWF-1、XWF-7和YZJ-4。

酵母菌；破碎；總肽酶；發酵豆制品

Abstract：To construct a method for determining total peptidase activity in yeast cells, a L9(34) orthogonal array design generated based on single-factor experiments was employed to optimize conditions for yeast cell disruption. In the optimization, the effects of 4 conditions for yeast cell disruption on total free amino acid amount in reaction system were dealt with. Snailase dose of 10 mg/mL, ultrasonic power of 500 W, ultrasonic treatment time of 8 min and ultrasonic operation interval of 5 s were found optimum. Under these optimum conditions, 61 yeast strains originated from unique Guizhou-style fermented soybean products were subjected to total peptidase activity determination, and 4 of them, namely WCF-5, XWF-1, XWF-7 and YZJ-4, were found have higher pepetidase activity.

Key words：yeast；disruption；total peptidases；fermented soybean products

大豆發酵食品，因富含豐富的營養成分和特殊的“一、二次生理活性物質”，倍受世界各國的高度重視[1]。大豆發酵食品除突出的營養健康功能外[2]，獨特的風味特征日益成為市場需求劇增的決定性因素[3]，而產品特征風味的形成主要取決于大量揮發與非揮發化合物之間的綜合平衡，在形成這些化合物的生化途徑中，以蛋白質降解及其氨基酸代謝最為關鍵[4]。因為蛋白質網絡結構破裂所引起的質構改變，有利于滋香味化合物的釋放，降解產生的短肽和游離氨基酸，不僅直接賦予產品滋味[5]，而且還作為揮發性化合物的前體，經氨基酸水解酶、轉氨酶等催化進行次生代謝或者與還原糖進行Maillard反應，形成大量的揮發性風味物質[6-7]。目前，篩選高蛋白酶、高肽酶、高氨基酸水解酶和轉氨酶的菌株，進行擴培菌劑制備和菌群強化發酵，已成為縮短高蛋白發酵食品后熟期的主要途徑。

研究資料表明，酵母菌作為發酵食品中常見的益酵菌株之一，可利用自身酶系進行發酵，產生大量酯香、醇香等風味物質，在醬油、腐乳等傳統發酵豆制品的后熟期，酵母菌發酵對風味成分形成也起到了不容忽視的作用[8]。肽酶是能分解蛋白短肽的酶類總稱，大多存在于微生物細胞內，在發酵過程中當細胞自溶后，便釋放肽酶水解肽類形成氨基酸，作為風味前體。因此，為了構建酵母細胞總肽酶活力的測定方法，本實驗對酵母細胞破碎方法和條件進行優化，同時對源于貴州特色發酵豆制品的酵母菌進行高肽酶菌株篩選，為生產應用提供益酵菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

實驗菌株：從貴州各地極具風味特色的發酵制品中分離純化出來的酵母菌株，共61株。菌株來源及編號見表1。其中，用于酵母細胞破碎實驗的菌株編號為ZF-5。

表1 供試菌株來源及編號Table 1 Sources and numbers of tested strains

培養基：虎紅培養基購于上海盛思生化科技有限公司；PDA液體培養基為實驗室自制[9]。

大豆肽粉購于上海西王淀粉有限公司(執行標準為QB/T 2653—2004《大豆肽粉》)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉、溶菌酶、茚三酮、亮氨酸、乙酸、乙酸鈉、乙醇、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

VCX750超聲細胞破碎儀 美國Sonics公司；冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亮氨酸標準曲線的測定

準確取50mg/L的亮氨酸標準溶液[10]。取8支20mL具塞刻度試管并編號，參照文獻[11]中操作步驟加入各種試劑，蓋上玻璃塞，混勻。再在100℃水浴中加熱15min(加熱時封口)，取出后立即置于冷水中迅速冷卻。然后迅速向每管中加入5mL 95%乙醇，塞好塞子，猛搖試管，此時溶液呈紫色。然后用60%乙醇稀釋至20mL，以0號管為參比進行調零，于570nm波長處測定溶液的吸光度，重復3次，然后繪制標準曲線，求出線性方程[11]。得出亮氨酸標準曲線線性方程為y＝0.8335x－ 0.0328，R2＝0.9978。

1.3.2 酵母菌總肽酶活力測定

酵母菌總肽酶活力測定的流程：

1.3.2.1 菌種復壯活化

對所獲菌株進行平板劃線培養后染色鏡檢，觀察菌體形態與原菌株記錄結果是否一致，純化檢查合格者，釣菌進行保種工作。將菌種接種于液體PDA培養基中，(28±1)℃條件下培養48～72h，反復轉接2～3次，使其恢復良好的生長傳代能力。

1.3.2.2 收集菌體

將活化好的菌株5mL接種于50mL液體PDA培養基中，于(28±1)℃條件下培養48h左右，取菌液于4℃條件下10000r/min離心5min，得到菌體細胞。上清液置4℃冰箱保存備用。

1.3.2.3 酵母菌總肽酶液的制備[12]

將所獲菌體用生理鹽水反復沖洗2～3次后，與標準比濁管比對菌濃度為1.5×108CFU/mL左右，菌體離心后使其懸浮在4mL含有40mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h，使酶與菌體完全反應，然后10000r/min離心5min，將所獲沉淀，即酵母菌球形體懸浮于10mL pH7.5的Tris-HCl緩沖液中冰浴超聲破碎，條件為功率500W，超聲時間間隔5s，總超聲時間8min。超聲完成后將菌液10000r/min離心5min，收集上清液。取1.3.2.2節的上清液以及超聲破碎得到的上清液各0.5mL于小試管中。該液體即為待測肽酶液。

1.3.2.4 肽酶活力測定反應體系

取制備的肽酶液1mL，加入質量濃度2g/100mL的無菌大豆肽溶液1mL，置于3mL pH7.5的Tris-HCl緩沖液中反應過夜[13]，最后取反應液1mL，測定其中游離氨基酸總量。

1.3.3 反應體系中游離氨基酸總量計算

吸取1mL反應液，置于20mL干燥具塞刻度試管中，加入1mL無氨蒸餾水。其他操作步驟與制作標準曲線方法相同。根據顯色液的吸光度，在標準曲線上查出相應的氨基酸量，反應體系中的游離氨基酸總量以每100mL反應液中的氨基酸含量(mg)表示。

式中：m＇為從標準曲線查得的氨基酸的質量/μg；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測定時所取樣品液體積/mL；m為樣品質量/g。

2 結果與分析

2.1 影響總肽酶活力的酵母菌破碎單因素試驗

為了篩選高肽酶活力的菌株，需要對供試菌株進行細胞破碎，使其胞內肽酶能夠溶出，以便與反應底物充分結合。目前酵母細胞的破碎方法主要有酶法、機械破碎法、化學滲透法、液氮凍融法等，但是無論采用哪種單一的方法破碎效果均不理想，而且單一方法對酶活力影響較大[14]。故本實驗采用酶法與機械破碎即超聲破碎相結合來進行酵母菌細胞破碎。

2.1.1 蝸牛酶添加量對總肽酶活力的影響

蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶[15]。可以用于植物及酵母細胞壁的破碎，因此廣泛用于細胞生物學和基因工程學的研究。將離心獲得的菌體等量懸浮于4mL含有1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，分別添加蝸牛酶10、30、50、70mg，置37℃水浴鍋中水浴3h，然后再于超聲功率500W，超聲時間間隔5s條件下超聲破碎10min。得到的酶液與多肽溶液反應，最后測定反應體系中游離氨基酸總量，結果見圖1。

圖1 蝸牛酶添加量對體系中游離氨基酸總量的影響Fig.1 Effect of snailase dose on total free amino acid amount in reaction system

由圖1可知，隨著蝸牛酶添加量的增大，樣品中游離氨基酸總量不斷升高。當蝸牛酶添加量增大到30mg后，樣品中游離氨基酸總量升高趨勢緩慢，當蝸牛酶添加量增大到50mg后趨于穩定。綜合考慮到蝸牛酶添加過量會造成結果偏高以及成本等因素，選擇蝸牛酶添加量控制在30～50mg之間。

2.1.2 超聲破碎功率對總肽酶活力的影響

將離心獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為100、300、500、700W條件下超聲10min，超聲時間間隔5s。得到的酶液與多肽溶液反應，最后測定反應體系中游離氨基酸總量，結果見圖2。

圖2 超聲功率對體系中游離氨基酸總量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on total free amino acid amount in reaction system

由圖2可知，隨著超聲功率的不斷增大，樣品中游離氨基酸總量先是升高隨后降低。考慮到超聲功率太大會使酶活力有所下降，故選擇功率在300～500W之間。

2.1.3 超聲破碎時間對總肽酶活力的影響

獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為500W條件下分別超聲1、5、10、15、20min，超聲時間間隔5s。得到的酶液與多肽溶液反應，最后測定反應體系中游離氨基酸總量，結果見圖3。

圖3 超聲時間對體系中游離氨基酸總量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on total free amino acid amount in reaction system

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，樣品中游離氨基酸總量先是不斷升高，當時間增大到10min左右時樣品中游離氨基酸總量升到最大值，隨后開始下降。故超聲時間可控制在10min左右。

2.1.4 超聲破碎時間間隔對總肽酶活力的影響

運用超聲波對細胞進行破碎的過程中會產生大量的熱，而溫度過高則會使酶失活。所以為保證總肽酶的活力，在冰浴超聲外，還要間隔一定時間，以使緩沖體系的溫度保持基本恒定。獲得的菌體等量懸浮于4mL含有50mg蝸牛酶、1mol/L山梨醇、0.02mol/L檸檬酸-磷酸(pH5.8)緩沖液中，置37℃水浴鍋中水浴3h。然后分別在超聲功率為500W條件下超聲10min，超聲時間間隔分別為1、3、5、7、9s。得到的酶液與多肽溶液反應，最后測定反應體系中游離氨基酸總量，結果見圖4。

圖4 超聲時間間隔對體系中游離氨基酸總量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic operation interval on total free amino acid amount in reaction system

由圖4可知，超聲時間間隔控制在1～7s之間，樣品中游離氨基酸總量趨于平穩，大于7s時游離氨基酸總量會下降。故可選擇時間間隔控制在5s左右。

2.2 酵母細胞破碎條件的優化

在單因素試驗的基礎上，對影響細胞總肽酶活力的蝸牛酶添加量、超聲時間、超聲功率和超聲時間間隔進行L9(34)正交試驗，因素水平見表2。正交試驗中，以反應體系中總游離氨基酸含量作為優化的指標，結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 酵母菌細胞破碎正交試驗結果Table 3 Orthogonal array layout and experimental results

表4 酵母破碎正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis for total free amino acid amount in reaction system with various cell disruption conditions

從表3可以看出，對酵母細胞總肽酶活力影響最大的因素是超聲時間，其次是蝸牛酶添加量，再次是超聲功率，最后是超聲時間間隔，即影響因素主次順序為C＞A＞B＞D。酵母細胞破碎最佳工藝條件為A2B3C1D2，即蝸牛酶添加量為10mg/mL、超聲功率500W、超聲時間8min、超聲時間間隔5s。由表4可知，4個因素中只有超聲時間是影響總肽酶活力的顯著性因素。

2.3 酵母菌肽酶活性測定

在最佳實驗組合：蝸牛酶添加量為10mg/mL、超聲功率500W、超聲時間8min、超聲時間間隔5s的條件下，對源于貴州特色發酵豆制品的61株酵母菌進行總肽酶活力測定，結果見表5。

表5 酵母菌總肽酶活性測定結果Table 5 Total peptidase activity of 61 yeast strains originated from unique Guizhou-style fermented soybean products

從表5可以看出，高產肽酶活力的酵母菌有4株，分別是WCF-5、XWF-1、XWF-7、YZJ-4。其中，肽酶活力最高的是采集樣品臭豆腐乳中分離提取出的WCF-5號酵母。

3 結 論

3.1 通過單因素試驗，得到各因素對酵母菌總肽酶活力影響程度從大到小依次是超聲時間＞蝸牛酶添加量＞超聲功率＞超聲時間間隔；超聲時間是影響總肽酶活力的顯著性因素。酵母菌細胞破碎的最佳組合條件為蝸牛酶添加量10mg/mL、超聲時間8min、超聲功率500W、超聲時間間隔5s。

3.2 篩選得到產總肽酶活力較高的酵母菌株4株，分別是WCF-5、XWF-1、XWF-7、YZJ-4。其中WCF-5號酵母所產總肽酶活力最高。

3.3 運用SPSS 11.5統計軟件對貴州各地所獲菌株的總肽酶活性進行差異性分析發現，來源于貞豐縣的菌株總肽酶活力最高，而來源于郎岱鎮的為最低。除這兩地的菌株總肽酶活力存在顯著差異而外，其他地方的菌株之間的差異均不明顯。

3.4 酵母菌細胞總肽酶活力整體比文獻報道的革蘭氏陽性桿菌總肽酶活力稍低，表明在發酵過程中分解肽類的菌群主體還是革蘭氏陽性桿菌，所以篩選高肽酶桿菌用于發酵對于縮短發酵后熟期也顯得尤為重要。

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Optimization of Yeast Cell Disruption and Screening of Strains with High Peptidase Activity

LI Yong-xia，ZENG Hai-ying，QIN Li-kang*
(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

TS214.2

A

1002-6630(2010)17-0302-05

2010-06-29

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2007]2033號)

李永霞(1986—)，女，碩士研究生，主要從事食品科學及營養與安全研究。E-mail：liyongxiaapo@sina.com

*通信作者：秦禮康(1965—)，男，教授，博士，主要從事食品科學及營養與安全研究。E-mail：likangqin@126.com