白藜蘆醇固體脂質(zhì)體制備工藝研究

樂文慧，黃早成，肖蘇堯，曹 庸*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

白藜蘆醇固體脂質(zhì)體制備工藝研究

樂文慧，黃早成，肖蘇堯，曹 庸*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

采用乙醇注入法制備白藜蘆醇脂質(zhì)體，用冷凍干燥技術(shù)制備固體脂質(zhì)體。以包封率為考察指標(biāo)，對(duì)芯材與壁材的配比、乳化劑的種類和用量、凍干保護(hù)劑甘露醇使用量、油水相之比分別進(jìn)行單因素考察。結(jié)果表明：最優(yōu)制備工藝條件為m(卵磷脂):m(膽固醇):m(白藜蘆醇)=10:2:1、乳化劑Tween 80、乳化劑用量0.2%(m/m)、凍干保護(hù)劑甘露醇使用量2%(m/m)、油水相體積比為1:10。最優(yōu)工藝制得的白藜蘆醇固體脂質(zhì)體的包封率為84.68%，采用乙醇注入法可制得包封率高的白藜蘆醇固體脂質(zhì)體，且方法簡(jiǎn)便易行。

白藜蘆醇；固體脂質(zhì)體；制備工藝；乙醇注入法

Abstract：Resveratrol liposomes were prepared using ethanol injection method and solid resveratrol liposomes were obtained after lyophilization. The effects of core material-to-wall material ratio, emulsifier type and amount, amount of mannitol as a cryoprotectant, oil phase-to-water phase ratio on entrapment efficiency were investigated in single factor experiments. The optimal preparation conditions of resveratrol liposome were as follows:lecithin-to-cholesterol-to-resveratrol ratio 10:2:1,amount of Tween-80 used as emulsifier 0.2%, amount of mannitol 2%, and oil phase-to-water phase ratio 1:10.The entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes prepared under these optimum conditions was 84.68%. Therefore, ethanol injection method for preparing resveratrol liposome can provide higher entrapment efficiency and feasibility.

Key words：esveratrol；solid liposome；preparation condition；ethanol injection method

近年來，國(guó)外學(xué)者對(duì)白藜蘆醇的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入研究，研究結(jié)果均表明白藜蘆醇活性顯著，高效低毒，是一類很有前景的抗氧化類藥物，對(duì)心血管具有雙向調(diào)節(jié)作用，能改善微循環(huán)，具有顯著的抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基以及抑制血小板聚集的作用，具有預(yù)防動(dòng)脈硬化、防止冠心病、降低血清和肝臟的脂質(zhì)、保護(hù)肝臟以及抗癌等多方面的活性[1-4]。

白藜蘆醇在光、熱和氧化劑的作用下容易被氧化降解[5]，在一定程度上限制了其在醫(yī)藥和食品等行業(yè)的應(yīng)用。脂質(zhì)體作為藥物和功能性成分的載體，是一種較新的微膠囊化技術(shù)，具有有效保護(hù)被包裹藥物和功能性成分、防止被包裹藥物和功能性成分被氧化、提高其穩(wěn)定性和生物利用度、并具有靶向性、生物可降解、無免疫抑制作用等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。脂質(zhì)體大都應(yīng)用于化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域中，而近年來脂質(zhì)體在食品中應(yīng)用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[9-12]，并且顯示出巨大的應(yīng)用潛力[13]。

白藜蘆醇脂質(zhì)體的研究報(bào)道較少，主要集中于醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究[14]，關(guān)于制備工藝的研究較少。本實(shí)驗(yàn)為增加白藜蘆醇的水溶性和穩(wěn)定性，采用乙醇注入法制備白藜蘆醇固體脂質(zhì)體，以白藜蘆醇的包封率為考察指標(biāo)，對(duì)影響固體脂質(zhì)體包封率的主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇(純度為98%) 湖南省林產(chǎn)化工工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大豆卵磷脂 廣州威佳科技有限公司；膽固醇上海聚源生物科技有限公司。

無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、β-環(huán)糊精、甘露醇、Tween 60、Tween 80、三氯甲烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蔗糖、葡萄糖、正己烷、環(huán)己烷等(均為分析純)；乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10ATVP plus高效液相色譜儀 日本島津公司；Diamonsil C18色譜柱(200mm×4.6mm，5μm) 迪馬公司；HJ-6磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FD-1PF冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；5417R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 脂質(zhì)體白藜蘆醇含量測(cè)定方法

采用色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為V(乙腈):V(水)＝43:57，流速為lmL/min，柱溫為室溫(25℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm，進(jìn)樣量為20μL。精確稱取白藜蘆醇5.0mg，用甲醇溶解為0.5mg/mL的儲(chǔ)備液，移取儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100μg/mL的白藜蘆醇甲醇溶液，進(jìn)樣20μL，以峰面積x對(duì)質(zhì)量濃度y作線性回歸方程為y=0.1383x+0.158(R2＝0.9985)，在白藜蘆醇質(zhì)量濃度為20～100μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為97.68%，RSD為1.05%(n=5)。

1.4 包封率測(cè)定方法

白藜蘆醇總量(m總/mg)測(cè)定：精密稱取制備好的白藜蘆醇固體脂質(zhì)體100mg，用乙醚及乙醇混合液(2:1，V/V)通過加熱、超聲破壁使白藜蘆醇游離出來，50℃揮發(fā)乙醚，甲醇定容至10mL，靜置取清液1mL再用甲醇定容至10mL。按1.3節(jié)方法檢測(cè)白藜蘆醇總量。

游離白藜蘆醇量(m游離/mg)測(cè)定：精密稱取制備好的白藜蘆醇固體脂質(zhì)體50mg，加入5mL丙酮，12000r/min離心30min，將脂質(zhì)體中游離白藜蘆醇分離出來，取1mL清液用甲醇定容至10mL。按1.3節(jié)方法檢測(cè)游離白藜蘆醇量。按下式計(jì)算包封率：

1.5 固體脂質(zhì)體制備方法優(yōu)化

白藜蘆醇固體脂質(zhì)體的制備工藝流程：稱取一定量的磷脂、膽固醇及白藜蘆醇→加入適量的無水乙醇與乙醚(1:2，V/V)中→水浴至溶液澄清(40～50℃)→用注射器快速將其注入含有甘露醇及乳化劑的30mL水相中→300～400r/min攪拌5min→減壓揮發(fā)除去有機(jī)溶劑→避光冷凍干燥→白藜蘆醇固體脂質(zhì)體。

1.5.1 壁材的優(yōu)化

以白藜蘆醇:卵磷脂質(zhì)量比為1:6為條件制備白藜蘆醇固體脂質(zhì)體，考察壁材比[m(卵磷脂):m(膽固醇)]分別為4:1、5:1、6:1、8:1和10:1，考察芯材與壁材比[m(白藜蘆醇):m(卵磷脂):m(膽固醇)]分別為1:10:1.25、1:10:1.667、1:10:2、1:8:2、1:16:2和1:20:2。

1.5.2 乳化劑的選擇

稱取0.8mg卵磷脂、0.16mg膽固醇和0.1mg白藜蘆醇溶解于2mL乙醇與4mL乙醚的混合溶劑中，分別快速注入含有Tween 60或Tween 80及含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%甘露醇的30mL水相中，300～400r/min攪拌5min，35℃條件下減壓去除有機(jī)溶劑，冷凍干燥，其水相中Tween 60或Tween 80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.4%、0.5%。

1.5.3 凍干保護(hù)劑甘露醇使用量

稱取0.8mg卵磷脂、0.16mg膽固醇和0.1mg白藜蘆醇溶解于2mL乙醇與4mL乙醚的混合溶劑中，分別快速注入含有甘露醇的水相中，300～400r/min攪拌5min，35℃條件下減壓去除有機(jī)溶劑，冷凍干燥，其水相中甘露醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%。

1.5.4 油水相體積比對(duì)包封率的影響

采用0.8mg卵磷脂、0.16mg膽固醇和0.1mg白藜蘆醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甘露醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Tween 60為條件制備白藜蘆醇固體脂質(zhì)體，考察油水相之比對(duì)包封率的影響，選擇油水相體積比分別為1:5、1:10、1:30。

1.5.5 正交試驗(yàn)確定白藜蘆醇脂質(zhì)體配方

在單因素初步試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定白藜蘆醇脂質(zhì)體配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材的優(yōu)化

膽固醇對(duì)于脂質(zhì)體起著膜流動(dòng)性調(diào)節(jié)作用，可使相變溫度以下處于固態(tài)的磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)防止類脂鏈結(jié)晶化，提高包封率，對(duì)考察壁材比的樣品進(jìn)行包封率的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，在m(卵磷脂):m(膽固醇)對(duì)包封率的影響較小，在5:1～10:1的范圍內(nèi)包封率較高。

圖1 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)包封率的影響Fig.1 Effect of lecithin-to-cholesterol ratio on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

芯材與壁材的配比是決定脂質(zhì)體的包封率的關(guān)鍵因素，芯材過多，超出磷脂的承載能力，則無法形成包封率較高的脂質(zhì)體；磷脂過多，脂質(zhì)體所包含的有效成分降低。對(duì)考察芯材與壁材比的樣品進(jìn)行包封率測(cè)定，結(jié)果如圖2、3所示。由圖2、3可以看出，m(白藜蘆醇):m(卵磷脂):m(膽固醇)＝1:10:2時(shí)包封率相對(duì)較高，故選定芯壁材比為m(白藜蘆醇):m(卵磷脂):m(膽固醇)＝1:10:2。

圖2 膽固醇含量對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of cholesterol amount on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

圖3 卵磷脂含量對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of lecithin amount on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

2.2 乳化劑的選擇

非離子型乳化劑是一種較為安全的乳化劑，在配方中加入適量比例的非離子型乳化劑，可以增加脂溶性成分的溶解度，提高脂質(zhì)體的包封率。不同乳化劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，用0.2% Tween 80作乳化劑的樣品測(cè)得包封率最高，所以選用0.2%的Tween 80作乳化劑。

圖4 乳化劑含量對(duì)包封率的影響Fig.4 Effects of emulsifier type and amount on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

2.3 凍干保護(hù)劑甘露醇使用量的考察結(jié)果

凍干保護(hù)劑可以防止脂質(zhì)體在冷凍干燥過程中活性成分白藜蘆醇的滲漏，保持脂質(zhì)體的顆粒形態(tài)，防止脂質(zhì)體表面在凍干過程中產(chǎn)生皺縮現(xiàn)象。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了甘露醇、蔗糖、葡萄糖、β-環(huán)糊精作為凍干保護(hù)劑的效果，結(jié)果顯示用甘露醇作凍干保護(hù)劑外觀效果較好，所以進(jìn)一步考察甘露醇的用量。由圖5可知，甘露醇用量為2%時(shí)包封率最高，所以選擇2%的甘露醇作凍干保護(hù)劑。

圖5 甘露醇用量對(duì)包封率的影響Fig.5 Effect of mannitol amount on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

2.4 考察油水相體積比

圖6 油相和水相體積比對(duì)包封率的影響Fig.6 Effect of oil phase-to-water phase ratio on the entrapment efficiency of solid resveratrol liposomes

由圖6可知，油水相體積比為1:10和1:30時(shí)包埋率均較高，分別為75.8%和76.4%，相差不大，從凍干的角度來考慮，水相用量過大凍干時(shí)間長(zhǎng)、能耗高，因而選擇1:10的油水相比。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定白藜蘆醇脂質(zhì)體配方

表1 L16(45)正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

根據(jù)制備白藜蘆醇脂質(zhì)體的單因素試驗(yàn)分析，影響白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率主要因素有卵磷脂與白藜蘆醇質(zhì)量比、膽固醇與白藜蘆醇質(zhì)量比、乳化劑Tween 80的用量、凍干保護(hù)劑甘露醇的用量以及油水相體積比。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)以確定白藜蘆醇脂質(zhì)體最優(yōu)制備條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

以白藜蘆醇脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。

表2 L16(45)正交試驗(yàn)的因素和水平Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

從表2可看出，采用乙醇注入法制備白藜蘆醇脂質(zhì)體的最優(yōu)配比為A1B1C4D2E1，即卵磷脂:白藜蘆醇(質(zhì)量比)10:1、膽固醇:白藜蘆醇(質(zhì)量比)2:1、Tween 80用量0.2%、甘露醇用量2%、油相:水相(體積比)1:10。因素對(duì)包封率的影響由主到次依次為A＞C＞E＞D＞B。在A1B1C4D2E1條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包封率均值為84.68%，證明正交試驗(yàn)結(jié)果可信。

3 結(jié) 論

脂質(zhì)體的分離是測(cè)定包封率的關(guān)鍵步驟，目前常用的分離方法有透析法、離心法和凝膠過濾法。本實(shí)驗(yàn)采用離心法測(cè)包封率，測(cè)定方法更為簡(jiǎn)便，結(jié)果較準(zhǔn)確。

白藜蘆醇固體脂質(zhì)體最優(yōu)制備條件為1.0mg卵磷脂、0.2mg膽固醇和0.1mg白藜蘆醇溶解于1mL乙醇與2mL乙醚混合溶劑中，加熱溶解溫度40℃。快速注入到含2%甘露醇和0.2% Tween 80的30mL蒸餾水水相中，300～400r/min攪拌5min，減壓揮發(fā)除去溶劑，避光冷凍干燥得固體脂質(zhì)體，包封率為84.68%。固體脂質(zhì)體提高了白藜蘆醇的穩(wěn)定性和溶解度。

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Preparation of Solid Resveratrol Liposomes

YUE Wen-hui，HUANG Zao-cheng，XIAO Su-yao，CAO Yong*
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)18-0059-04

2009-10-08

樂文慧(1984—)，女，碩士研究生，主要從事食品工程研究。E-mail：973966526@qq.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，主要從事天然活性物分離及活性研究。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn