兩種海藻提取物抗水產動物病原菌活性的初步研究

路 遠, 閆茂倉, 徐宏翔, 南春容

(1. 溫州醫學院 生命科學學院, 浙江 溫州 325035; 2. 浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江 溫州 325005)

兩種海藻提取物抗水產動物病原菌活性的初步研究

路 遠1, 閆茂倉2, 徐宏翔1, 南春容1

(1. 溫州醫學院 生命科學學院, 浙江 溫州 325035; 2. 浙江省海洋水產養殖研究所, 浙江 溫州 325005)

研究了兩種大型海藻——羊棲菜(Sargassum fusiforme)、條滸苔(Enteromorpha clathrata)提取物對11種水產動物病原菌的抑制活性。結果顯示： 羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制作用最明顯, 抑菌圈可達21.6 mm; 薄層層析表明羊棲菜乙醇粗提取物乙酸乙酯相有6條層析帶, 其中Rf=0.54帶對哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑制作用最強, 抑菌圈可達13.6 mm; 條滸苔乙醚粗脂對11種水產動物病原菌均表現出了較強的抑制作用, 其中對燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的抑制作用最強, 抑菌圈可達24.7 mm; 進一步的實驗顯示, 條滸苔乙醚粗脂3種洗脫組分抗菌性均比粗脂減弱了, 而其95%乙醇洗脫組分對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的抑菌圈仍可達13.8 mm。說明利用羊棲菜、條滸苔為開發海洋藥物資源提供了可能。

羊棲菜(Sargassum fusiforme); 條滸苔(Enteromorpha clathrata); 提取物; 水產動物病原菌; 抗菌活性

近20年來, 我國的水產養殖業得到了飛速發展,但隨著集約化養殖程度的不斷提高, 養殖水域的污染逐漸加重, 水產病害日益嚴重, 用藥量也越來越大[1]。細菌性疾病是水產養殖魚類最主要的病害之一[2], 其中弧菌病尤為嚴重, 給我國的水產養殖業造成了巨大的危害。長期以來我國主要依靠各種農藥、抗生素、喹諾酮類等化學藥物及各種消毒劑對水產動物病害進行控制和防治。抗菌藥物的大量使用不僅使藥物的作用效果受到制約, 使致病菌產生耐藥性, 而且一些藥物殘留于水產動物的體內及養殖水域, 給養殖環境造成了嚴重的污染, 同時也會引發一系列的水產品質量安全問題[3]。

羊棲菜(Sargassum fusiforme)和條滸苔(Enteromorpha clathrata)是浙江沿海常見的大型藻類。羊棲菜隸屬于褐藻門(Phaeophyta)、馬尾藻科(Sargassaceae)、馬尾藻屬(Sargassum), 在我國溫州洞頭地區大量栽培。已有的研究發現, 海藻中不僅存在許多抑制細胞毒活性、抗炎等作用的物質[4,5], 而且具有較好的抗細菌、抗病毒的作用[6], 如從羊棲菜中分離出來的 SP4-2組分對 HIV-1感染有較好的抑制作用[7]。條滸苔隸屬綠藻門(Chlorophyta)、石莼科(Ulvaceae)、滸苔屬(Enteromorpha), 不僅是沿海人民采集食用或用作飼料的藻類, 可以鮮食, 而且其乙醇提取物乙酸乙酯相對金黃色葡萄球菌具有抑制作用[8]。但近年來隨著海洋生態環境污染及水體富營養化程度的加重, 滸苔大量繁殖, 造成了嚴重的“綠潮”災害, 對海洋生態環境構成了巨大的威脅[9]。因此如何加大對該藻類的開發和利用成為目前亟待解決的問題。本實驗以羊棲菜和條滸苔為材料, 用不同有機溶劑提取其活性物質, 并驗證各種提取物對 11種水產動物病原菌的抑制效果, 為更好地開發利用羊棲菜和條滸苔資源開辟新的途徑, 同時為將其開發為海洋天然藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 供試海藻

羊棲菜(Sargassum fusiforme), 購自浙江省溫州市洞頭縣羊棲菜養殖戶。

條滸苔(Enteromorpha clathrata), 采自浙江省寧波市北侖港, 野生。

1.2 指示菌

實驗所用指示菌由浙江省海洋水產養殖研究所,浙江省近岸水域生物資源開發和保護重點實驗室提供。具體如下：

(1) 需鈉弧菌[10](Vibrio natriegens), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(2) 副溶血弧菌[11](Vibrio parahaemolyticus), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(3) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 源于青蛤(Cyclina sinensis);

(4) 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 源于黃姑魚(Nibea albiflora);

(5) 哈氏弧菌[10](Vibrio harveyi), 源于文蛤(Meretrix meretrix);

(6) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于美國紅魚(Sciaenops ocellatus);

(7) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei);

(8) 哈氏弧菌(Vibrio harveyi), 源于管角螺(Hemifusus tuba)。

(9) 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida), 源于條石鯛(Oplegnathus fasciatus);

(10) 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 源于鋸緣青蟹(Scylla serrata);

(11) 燦爛弧菌(Vibrio splendidus), 源于美國紅魚(Sciaenops ocellatus);

2 方法

2.1 海藻提取物的制備

將新鮮健康羊棲菜、條滸苔去除表面雜藻、泥沙及附著物, 用蒸餾水清洗去除表面鹽分, 50℃下烘干, 粉碎至40目。取兩種海藻粉末各30 g分別置于150 mL的無水乙醇中, 50 ℃溫浴浸提6 d, 分兩次浸提合并提取液, 過濾, 得兩種海藻乙醇浸提液, 真空旋轉蒸干, 得到黑褐色的固體浸膏, 質量分別為1.18、3.00 g; 兩種海藻石油醚提取物操作同上, 質量分別為0.60、0.24 g。將得到的兩種海藻乙醇粗提物分別混懸于10倍的蒸餾水中, 充分混懸后用乙酸乙酯進行萃取, 得到乙酸乙酯相和水相, 分別蒸干, 乙酸乙酯相質量分別為0.06、0.13 g; 水相質量分別為0.41、0.87 g。

2.2 活性組分的TLC制備層析

本實驗對羊棲菜乙酸乙酯相, 用薄層層析法(TLC)分離, 薄層層析板采用硅膠G型。對于羊棲菜的乙酸乙酯相選用的是石油醚： 丙酮(3 ： 1)作為層析液進行層析分離。用碘缸和石英紫外檢測儀檢測出特征帶, 刮取特征帶(特征帶用層析后化合物移動的距離與展層劑移動距離的比值用 Rf表示共得 6個帶)Rf值分別為 0.00、0.24、0.34、0.40、0.45、0.54, 質量分別為 0.01、0.01、0.02、0.01、0.02、0.03 g。

2.3 索氏抽提粗脂的制備

取兩種海藻各30 g置于索式抽提器中, 底部容器分別裝入150 mL的乙醚、氯仿, 分別在45 ℃和72 ℃的水浴條件下回流抽提 3天, 真空旋轉蒸干,得到粗脂提取物, 羊棲菜、條滸苔乙醚粗脂質量分別為 0.62、0.25 g; 氯仿粗脂的質量分別為0.39、0.31 g。

2.4 海藻乙醚粗脂柱層析洗脫制備

羊棲菜、條滸苔乙醚粗脂經硅膠(G60型)柱層析分離, 先后用苯、乙酸乙酯和 95%的乙醇進行洗脫,將洗脫下來的洗脫液分別蒸干, 得苯組分質量分別為0.03、0.10 g; 乙酸乙酯組分質量分別為0.18、0.05 g; 乙醇組分質量分別為0.10、0.08 g。

2.5 抗菌實驗

采用平板擴散法[12]。將各種病原菌接種到2216E液體培養基中, 培養18 h后, 用0.85%無菌生理鹽水調節菌液濃度為 5.0×106CFU/mL, 分別取 200 μL菌液均勻涂布于 2216E固體培養基平板上。將提取物溶解到相對應的浸提溶劑或洗脫劑配成 0.1 g/mL濃度的藥液, 用移液槍吸取藥液10 μL滴于已滅菌的圓形紙片上(Φ6 mm)待完全擴散后, 晾干, 貼于涂布有病原菌的固體培養基平板上, 28 ℃恒溫培養24 h后, 觀察并測量抑菌圈的大小。

3 結果與分析

3.1 兩種海藻不同有機溶劑提取物抗水產動物病原菌活性

表 1顯示, 羊棲菜的較高極性浸提物要比低極性浸提物活性略強。如羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相和氯仿抽提物對溶藻弧菌的抑制作用最強, 而石油醚和乙醚提取物對其的抑制作用次之。

表 2顯示, 條滸苔的低極性浸提物要比高極性浸提物的活性要強。如條滸苔石油醚提取物對需鈉弧菌和哈氏弧菌(文蛤)的抑制作用最強; 乙醚粗脂對燦爛弧菌的抗性最強; 乙醇提取物乙酸乙酯相和水相對11種水產病原菌均沒有抗性。

3.2 羊棲菜乙酸乙酯相薄層層析分離組分抗水產動物病原菌活性

表3顯示, 羊棲菜乙酸乙酯相經薄層層析(TLC)

分離后各層帶對溶藻弧菌仍保持較強的活性, 而且Rf0.45帶、Rf0.54帶對11種水產動物病原菌均具有較好的抗性。

表1 羊棲菜提取物抗水產動物病原菌活性結果Tab. 1 Antimicrobial activities of the extracts from S. fusiforme against aquatic animal pathogens

表2 條滸苔提取物抗水產動物病原菌活性結果Tab. 2 Antimicrobial activities of the extracts from E. clathrata against aquatic animal pathogens

3.3 兩種海藻乙醚粗脂洗脫組分抗水產動物病原菌活性

表4和表5顯示, 兩種海藻乙醚粗脂三種洗脫組分的抗菌性比粗脂的抗菌性略有減弱, 原因可能是共同起作用的活性物質被分開, 從而在分離后降低了其抗菌能力。

4 討論

本實驗顯示, 大型海藻羊棲菜、條滸苔體內含有抗水產動物病原菌的活性物質, 其中羊棲菜不同提取液浸提物對溶藻弧菌具有最明顯的抑制作用, 條滸苔乙醚粗脂對燦爛弧菌的抑制作用最強。但有活性的提取物均為粗提物, 含有多種成分, 化學性質復雜, 對實驗結果影響較大。如在薄層層析分離實驗當中發現,Rf值最大的兩條帶的抗性最好, 而林雄平等[13]在羊棲菜提取物抗動植物病原菌活性的實驗中提到較低的Rf值對 3種動物病原菌具有較好的抑制作用, 可能是不同的實驗菌種對羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相各層帶敏感性不同造成的, 其中Rf=0.45帶、0.54帶的化學成分還有待進一步的研究分析; 從柱層析分離實驗結果來看, 粗脂中的活性物質分別在各洗脫組分當中, 各組分抗菌性略有減弱說明粗提物中的抑菌物質可能為多種成分共同起作用, 而且有幾種洗脫組分的基團它們之間可能存在相互作用, 或者被其他基團所屏蔽, 分離后屏蔽基團被分開, 抗菌活性才顯現出來。

徐年軍等在研究海藻乙醇提取物抗菌活性實驗中提到, 從不同門類海藻的抗菌活性看, 褐藻最強,紅藻次之, 而綠藻活性最弱[8]。而從本實驗的結果來看, 綠藻條滸苔乙醇提取物對本實驗指示菌沒有抗性, 但乙醚提取物中表現出的抗菌活性一定程度上超過了褐藻羊棲菜的活性, 可見不同藻類使用不同的溶劑提取得到的活性物質及其抗菌能力也不一樣。

表4 羊棲菜乙醚粗脂洗脫組分抗水產動物病原菌活性結果Tab. 4 Antimicrobial activities of three elution fractions of S. fusiforme against aquatic animal pathogens

表5 條滸苔乙醚粗脂洗脫組分抗水產動物病原菌活性結果Tab. 5 Antimicrobial activities of three elution fractions of E. clathrata against aquatic animal pathogens

利用海藻提取物添加到飼料中以替代抗生素等化學藥物在水產養殖病害防治方面已有一些研究。如 Immanuel 等[14]曾研究發現熱帶海藻石莼(Ulva luctucal)和馬尾藻屬的圍氏馬尾藻(Sargassum wightii)提取物具有抗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的活性, 其抑菌圈高達17.5 mm±0.81 mm、16.3 mm±0.47 mm, 并將提取物添加到飼料中喂養印度對蝦(Penaeus indicus), 發現印度對蝦體中的副溶血弧菌明顯地減少了。本文羊棲菜乙醇粗提物乙酸乙酯相和條滸苔乙醚粗脂分別對溶藻弧菌和燦爛弧菌有很強的抑制作用, 其有效成分的分離純化, 有待進一步的實驗研究。

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Antimicrobial activities of extracts from Sargassum fusiforme and Enteromorpha clathrata against aquatic animal pathogens

LU Yuan1, YAN Mao-cang2, XU Hong-xiang1, NAN Chun-rong1
(1. Life Science School, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035 China; 2. Zhejiang Mariculture Reseach Institute, Wenzhou 325005, China)

Sep., 30, 2009

Sargassum fusiforme; Enteromorpha clathrata; extract; aquatic animal pathogen; antimicrobial activity

Antimicrobial activities of extracts from two macro-algae, Sargassum fusiforme and Enteromorpha clathrata were assayed against 11 aquatic animal pathogens. The results showed that the ethyl acetate phase of ethanol extracts from S. fusiforme exhibited the strongest inhibition effect on Vibrio alginolyticus with an inhibition zone of 21.6 mm; the ethyl acetate phase of ethanol extracts from S. fusiforme had six chromatographic bands,among which the band with Rf=0.54 showed the strongest inhibition effect on Vibrio harveyi, with an inhibition zone was 13.6 mm; the crude fat of E. clathrata could inhibit all 11 aquatic animal pathogens, and the strongest inhibition effect was toward Vibrio splendidus with an inhibition zone of 24.7 mm. Moreover, the antimicrobial activities of the three elution fractions of the crude fat from E. clathrata was weaker than that of the crude fat, the inhibition zone of the 95% ethanol elution fractions to Pseudomonas putida was still up to 13.8 mm. Our results support the feasibility of developing marine drugs from S. fusiforme and E. clathrata.

R931.77

A

1000-3096(2010)10-0028-05

2009-09-30;

2009-12-11

浙江省自然科學基金(Y506224); 溫州市科技計劃項目(S20100020)

路遠(1984-), 男, 山東淄博人, 碩士, 主要從事海藻提取物活性的研究, 電話： 15858832152, E-mail： luyuan11@126.com; 南春容, 通信作者, 電話： 0577-86699360, E-mail： nanchunrong@163.com

(本文編輯：張培新)