液相色譜串聯質譜法測定谷物類農產品中苯氧羧酸類除草劑多殘留

程 靜，丁 磊，蔣俊樹,*，盧業舉

(1.安徽國家農業標準化與監測中心，安徽 合肥 230051； 2.安徽大學化學化工學院，安徽 合肥 230039)

液相色譜串聯質譜法測定谷物類農產品中苯氧羧酸類除草劑多殘留

程 靜1,2，丁 磊2，蔣俊樹1,2,*，盧業舉1,2

(1.安徽國家農業標準化與監測中心，安徽 合肥 230051； 2.安徽大學化學化工學院，安徽 合肥 230039)

研究液相色譜-串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)測定大米、小麥、玉米等谷物中6種苯氧羧酸類除草劑(2,4-DP、2,4-D、2,4,5-TP、2,4,5-T、2,4-DB、MCPA)殘留量的方法。通過對樣品前處理進行優化研究，樣品經乙腈提取，乙酸酸化，凈化后，采用HPLC-ESI-MS/MS檢測分析，在多反應監測模式(MRM)下，外標法定量。方法的檢出限為0.005～0.01mg/kg，在0.01～0.5mg/L范圍內線性關系良好(相關系數r2＞0.99)，在0.2mg/kg添加水平下，平均添加回收率86.1%～96.8%，該方法簡便、高效、準確，各項技術指標均滿足國內外有關苯氧羧酸類除草劑殘留限量要求，可用于大米、小麥、大豆等農產品中苯氧羧酸類除草劑殘留的分析測定。

苯氧羧酸類除草劑；谷物；高效液相色譜-串聯質譜

自1945年2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)商品化以來，以2,4-D、二甲四氯(MCPA)等為代表的苯氧羧酸類除草劑在小麥、水稻、大豆、玉米等農業生產中得到了廣泛地使用[1-2]。目前，苯氧羧酸類除草劑是世界上第二大選擇性除草劑，也是世界上第一大殺除闊葉雜草的除草劑。此類除草劑本身中等毒性，但是其代謝產物(特別是一些鹵化物)對人類、生物體以及環境會造成危害，鑒于此，其在農產品中的殘留及對人類健康和環境造成的危害也越來越為人們所關注。歐盟、美國、日本和國際食品法典委員會(CAC)等國家與組織都制定嚴格的殘留限量，如日本規定2,4-D在大多農產品中的限量為0.05mg/kg，MCPA0.1mg/kg。

目前，對苯氧羧酸類除草劑多殘留分析的報道多采用氣相色譜法或氣質聯用法測定[3-10]，也基本集中在對土壤和水等環境樣品的研究[11-14]，而谷物類農產品中苯氧羧酸類除草劑多殘留檢測研究報道較少。由于此類化合物極性較強、穩定性較差、不易氣化，需衍生后才能用氣相色譜法或氣質聯用法測定[15]，整個操作過程步驟繁瑣、分析成本較高、檢測周期較長。液相色譜串聯質譜法測定谷物類農產品中苯氧羧酸類除草劑多殘留未見報道。本實驗建立液相色譜串聯質譜法可簡單、快速、準確定量分析小麥、大米、大豆、玉米等谷物類農產品中6種苯氧羧酸類除草劑方法，獲得了滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

2,4-DP、2,4-D、2,4,5-TP、2,4,5-T、2,4-DB、MCPA標準樣品 美國Accustandard公司；甲醇、乙腈、乙酸、甲酸(色譜純) 美國TEDIA公司；NaCl、無水MgSO4等試劑為分析純，無水MgSO4使用前需在650℃灼燒7h后于干燥器中保存；實驗用水為Milli-Q去離子高純水；有機微孔過濾膜(孔徑0.20μm)；50mL聚丙烯離心管；C18中性氧化鋁(500mg/3mL)。

用甲醇配制2,4-DP、2,4-D、2,4,5-TP、2,4,5-T、2,4-DB、MCPA 6種標準樣品標準儲備液(1000mg/L)，根據需要用流動相將混合中間標準溶液稀釋成適合質量濃度的混合標準工作溶液，現配現用。

6410 Triple Quad LC/MS液相色譜串聯質譜儀 美國安捷倫公司； Z-323 K離心機 德國Hermle公司；N-EVAPTM111氮吹儀 美國Organomation Associates公司；KQ5200 DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MS 3 basic混勻器 德國IKA公司；Milli-Q去離子水發生器 美國Millipore公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

稱取5g粉碎試樣(精確至0.01g)于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL 5%甲酸溶液+乙腈混合溶液(1:2，V/V)，劇烈振搖1min，使其完全混勻。加入4g無水硫酸鎂和1g氯化鈉，振搖1min，將離心管放入離心機中，以4000r/min離心2min。

1.2.2 凈化

取上述上層提取液于另一具塞塑料離心管，加入QuEChERS試劑(0.2g C18+0.1g中性氧化鋁+1g 硫酸鎂)，振搖1min，以8000r/min離心2min。取5.0mL上清液于40℃用氮氣緩慢吹干后用流動相定容至1.0mL，過0.20μm微孔濾膜，供儀器檢測。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18柱 (100mm×3.0mm，1.8μm)；柱溫：35℃；流速：0.30mL/min；進樣量：10μL；流動相：A：0.05%甲酸水溶液；B，乙腈；梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.2 質譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI－)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；干燥氣溫度250℃；干燥氣流速9L/min；霧化器壓力40psi；毛細管電壓3500V；對于所有的目標化合物，通過測定確定最佳的碰撞電壓以及相應的定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量條件。

2 結果與分析

2.1 樣品提取條件優化

一般來說，液相萃取是將酸性除草劑從基質中萃取出來的基本方法。溶劑的選擇對于多殘留的萃取是極其重要的，對于液液萃取，被分析物在兩種液相中的分配系數也是很重要的。苯氧羧酸類除草劑屬于酸性除草劑(pKa＜4)，苯氧羧酸類除草劑的化學結構中有一個共同的羧酸基功能團，在堿性條件下容易離解成鹽，易溶解于水相中，會降低苯氧羧酸類除草劑在有機相中的溶解度。因此，合適的pH值對于提取效率有很大的影響。實驗設計乙腈和乙腈+乙酸的萃取效果(圖1)。結果表明：隨著樣品提取體系中乙酸體積分數的逐漸增大，6種除草劑的回收率也逐漸增大，當樣品提取體系中乙酸體積分數高于5%時，所有除草劑的回收率都不再增高，故選用5%乙酸-乙腈(1:2，V/V)提取體系。由于大米、小麥、玉米等谷物主要是由高糖和碳水化合物組成的。因此，在這種條件下加入NaCl能使乙腈更容易與水分離，使苯氧羧酸有效進入乙腈相，從而提高了回收率，此外加入無水MgSO4吸收多余水分，促進被分析物進入有機相。

圖1 不同提取環境對6種苯氧羧酸類除草劑的回收率的影響Fig.1 Effect of solvents on recoveries of six phenoxy acid herbicides

2.2 凈化條件的優化

QuEChERS技術兼有SPE 的優點，而且在操作上比SPE更簡便，提取、凈化能一步完成，減少樣品損失。所用的樣品和溶劑量明顯少于液-液萃取(LLE)，常用C18、C8、硅酸鎂、活性炭、中性氧化鋁等作為吸附劑。在萃取后，乙腈相需要進一步凈化和干燥(分散固相吸附和MgSO4干燥)，吸附劑應具有吸附雜質且使被分析物進入乙腈相中的能力。在此程序中，不同的分散吸附劑對于凈化和回收率都有很大的影響。在傳統的多殘留快速檢測方法QuEChERS中，使用的分散固相萃取PSA吸附劑為弱酸性的陽(陰)離子交換劑，此吸附劑可以除去大米、小麥、玉米基質中的糖類及其他一些脂肪類的物質，但是由于苯氧羧酸類除草劑是極性較大的酸性除草劑，因此使用此離子交換劑會和羧酸類除草劑發生的作用，從而導致回收率的下降，本實驗優化了QuEChERS凈化方法，即優化了分散固相吸附劑。首先選用C18吸附劑代替QuEChERS中的PSA吸附劑，通過實驗發現，當使用C18時，由于C18吸附劑是反相吸附劑，它能夠吸附大米、小麥、玉米基質中淀粉、糖類，吸附比較徹底，6種苯氧羧酸類除草劑的回收率相比較使用弱酸性的陽(陰)離子交換劑有所升高，考慮到小麥、大米、玉米的復雜基質，除了含有淀粉、糖外，還含有碳水化合物、脂肪、蛋白質、色素等，因此單純使用C18達不到理想回收率及定量分析要求。由于活性炭和中性氧化鋁具有吸附此類物質的能力，盡管活性炭吸附色素比其他物質效果更好，但是它對苯氧羧酸類除草劑的吸附也是不容忽視的，實驗發現當使用C18+中性氧化鋁效果最佳。因此最終優化的分散固相吸附劑為C18+中性氧化鋁，通過實驗得出5g樣品中加入0.2g C18+0.1g中性氧化鋁+1g MgSO4為最佳凈化條件。

2.3 儀器條件的選擇

在LC-MS/MS分析中，色譜的分離和質譜數據的采集是同時進行的。為了使每個組分都得到分離和鑒定，以獲得最大的靈敏度，必須設置合適的色質分析條件，特別是質譜條件。

色譜條件包括色譜柱類型、流動相組成、流動相大小、柱溫等。質譜條件包括離子源、離子化模式、離子源溫度、霧化氣流量、質量掃描范圍、定量檢測模式等，這些都要根據樣品情況進行設定。混合基質標準樣品多反應監測(MRM)色譜圖見圖2，實驗條件選擇見表2。

圖2 混合基質標準樣品多反應監測(MRM)色譜圖(添加量為20 μg/kg)Fig.2 MRM chromatograms of six phenoxy acid herbicides in mixed matrix sample fortified at 20μg//kg

表2 多反應監測(MRM)條件Table 2 Conditions for MRM monitoring

2.4 線性關系、回收率、精密度與檢出限

在優化的測定條件下，配制一系列不同質量濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分定量離子的峰面積對質量濃度繪制標準曲線，線性關系和相關系數見表3。結果表明，在0.001～0.2mg/L范圍內，6種苯氧羧酸類除草劑的質量濃度和定量離子的峰面積呈良好的線性關系。采用在空白樣品中添加0.2mg/kg標準溶液的方法，分別對大米、玉米、小麥樣品中6種苯氧羧酸類除草劑進行 5個水平的添加回收率實驗，每個水平進行6次重復，得到結果的平均相對標準偏差為2.05%～4.37%。6種苯氧羧酸類除草劑劑殘留量的檢出限(LOD，RSN=3)為 0.005～0.01mg/kg(表 3)。

表3 6種苯氧羧酸類除草劑在稻米樣品中的線性關系、添加回收率、RSD和檢出限Table 3 Linear equations and detection limits of six phenoxy acid herbicides and recoveries from fortified rice and precisions for them

3 結 論

本實驗建立液相色譜串聯質譜(HPLC-ESI-MS/MS)法快速、準確測定了農產品中6種苯氧羧酸類除草劑殘留量。該方法具有快速、靈敏、準確和操作簡單的特點，各項技術指標均滿足國內外對苯氧羧酸類除草劑殘留檢測標準的要求，能夠很好的應用于大米、小麥、玉米等農產品中的苯氧羧酸類除草劑殘留分析檢測。

[1] 劉長令. 世界農藥大全 除草劑卷[M]. 北京: 化學工業出版社, 2002.

[2] 張一賓, 張懌. 世界農藥新進展[M]. 北京: 化學工業出版社, 2007.

[3] 衛鋒, 董振霖, 于玲. 氣相色譜-質譜聯用法檢測大米中多種苯氧羧酸類除草劑[J]. 分析測試學報, 2005, 24(增刊1): 304-306.

[4] SN 0661—1997 糧谷中2,4,5 - T的檢測[S].

[5] SN 0687—1997 糧谷油籽中禾草靈的檢測[S].

[6] SN 1392—2004 肉和肉制品中MCPA、MCPB的檢測[S].

[7] SN 0195—1993 肉和肉制品中2,4 -滴的檢測[S].

[8] MENG Chinkai, WERNER S L, FURLONG E T. 固相萃取和液相色譜/質譜/質譜在正離子和負離子模式下檢測水中的農藥殘留[J]. 環境化學, 2008, 27(1): 127-130.

[9] 匡華, 儲曉剛, 侯玉霞, 等. 氣相色譜法同時測定大豆中13種苯氧羧酸類除草劑的殘留量[J]. 中國食品衛生雜志, 2006, 18(6): 503-508.

[10] 辛國斌, 譚家鎰, 姚麗娟, 等. 尿中3種苯氧羧酸類除草劑的氣相色譜分析法[J]. 分析科學學報, 2007, 23(4): 429-432.

[11] GREEN E C, ABRAHAM M H. Investigation into the effects of temperature and stirring rate on the solid-phase extraction of diuron from water using a C18extraction disk[J]. Chromatography A, 2000, 885: 41-49.

[12] VALENZUELA A I, PICO Y, FONT G. Liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometric analysis of benzoylurea insecticides in citrus fruits[J]. Rapid Commun Mass Spectrum, 2000, 14: 572-577.

[13] POZO O, PITARCH E, SANCHO J V, et al. Determination of the herbicide 4-chloro-2-methylphenoxyacetic acid and its main metabolite,4-chloro-2-methylphenol in water and soil by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 923: 75-85.

[14] LAGANA A, BACALONI A, de LEVA I, et al. Determination of maize and grain herbicides and their transformation products in soil by use of soil column extraction then liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Chromatographia, 2002, 56(5/6): 337-343.

[15] 甲基化處理氣相色譜-質譜法同時檢測大米中12種酸性除草劑[J].質譜學報, 2005, 26(4): 206-210.

Determination of Multi-residues of Phenoxy Acid Herbicides in Cereals by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHENG Jing1,2，DING Lei2，JIANG Jun-shu1,2,*，LU Ye-ju1,2
(1. Center of Anhui National Agricultural Standardization and Monitoring, Hefei 230051, China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University, Hefei 230039, China)

A new method using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS)for the analysis of six phenoxy acid herbicide residues in cereals has been developed. The optimized sample pretreatment procedure consisted of extraction with acetonitrile, acidification with acetic acid and cleanup before the analysis on a LC-ESIMS/MS instrument. Separated analytes were determined using multiple reaction monitoring (MRM). Quantitation was performed using external standard method. The proposed method displayed a detection limit between 0.005 and 0.01 mg/kg and good linearity over the range from 0.01 to 0.5 mg/L, with ar2＞ 0.99. At a spike level of 0.2 mg/kg, mean recoveries from rice ranged between 86.1% and 96.8% for different analytes. The method is simple, efficient and sensitive, and its each performance characteristic meets the requirements for the determination of phenoxy acid herbicide residues in cereasl at home and abroad.

phenoxy acid herbicides；cereal；liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry(LC-ESI-MS/MS)

TS207.53

A

1002-6630(2010)20-0389-05

2010-03-10

國家質檢公益性行業科研專項(200810773)

程靜(1954—)，女，教授級高級工程師，本科，研究方向為食品質量安全分析檢測技術、

食品質量安全監督管理。E-mail：cj50303@yahoo.com.cn

*通信作者：蔣俊樹(1965—)，男，教授級高級工程師，碩士，研究方向為食品質量安全分析檢測技術。E-mail：jjs325@163.com