多效唑對沙田柚采后傷果的誘導抗病效應

張 鏡，刁俊明，黃思梅，刁樹平

(嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015)

多效唑對沙田柚采后傷果的誘導抗病效應

張 鏡，刁俊明，黃思梅，刁樹平

(嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015)

為研究多效唑處理采后沙田柚傷果的誘導抗病效應，在采后沙田柚果實中部表面分2層分別削約1cm2的傷口各5個，以多效唑溶液浸1min，預貯7d后單果包聚苯乙烯薄膜、室溫貯藏。貯藏前期果實傷口附近正常果皮先由淡橙黃轉為淺綠色，后又退綠至與正常果面一致顏色。傷口表面先微顯綠色，然后轉為紅褐色，隨貯期的延長褐色逐漸加深。傷口白皮層逐漸變硬，傷口下2～3mm內白皮層變為褐色。切片顯微觀察傷口附近細胞壁加厚，細胞內出現顆粒狀物。1.0mmol/L多效唑處理傷果，90d供試果感染率13.33%，與綠色南方無顯著差異。結果表明多效唑對采后沙田柚具明顯誘導抗病的作用。

沙田柚；采后；多效唑；誘導抗病

耐貯水果一般產量大、成熟期集中，果實采摘粗放，采后果實表面留下的微傷是病原菌侵入、造成果實腐爛的重要原因。采后水果若不及時進行防腐處理，貯藏期間將大量腐爛造成嚴重的經濟損失。水果傳統的化學防腐保鮮，以化學殺菌劑控制貯藏果實腐爛，用植物生長調節劑抑制呼吸消耗，保持果實品質[1-2]。由于病原菌抗藥性的不斷增強，采后水果防腐化學殺菌劑的使用濃度不斷增大，給消費者的健康與環境造成的不利影響愈趨嚴重。尋求更安全的水果采后防腐方法早已為水果采后的熱點與難點研究課題，近十余年來水果的誘導抗性防腐倍受水果采后學者的關注[3-4]。以水楊酸、β-氨基丁酸等化合物，以橄欖假絲酵母、膜醭畢赤酵等微生物，以及用γ-射線、離子輻射和熱水等物理因子處理采后蘋果、梨、甜橙與香蕉等，可誘導果實傷口附近組織的幾丁酶、苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖酶等抗菌酶的活性[5-11]，或誘導產生二甲基氧香豆素和東莨菪苷原等植保素[12-14]，從而增強處理果實的抗病性、降低果實的貯藏腐爛。

植物生長調節劑是影響植物生命活力的一類化合物，果實采后在適當條件下、以適當的植物生長調節劑處理可使其生命活力顯著提高，其抗病力、傷口愈合力得以激發與增強，將對采后果實的貯藏防腐，尤其是耐貯水果的長期貯藏具重要作用。多效唑是一種植物生長調節劑，具有延緩植物生長，抑制莖桿伸長，縮短節間、促進植物分蘗、增加植物抗逆性能，能顯著提高作(植)物產量，廣泛用于蔬菜、水果、糧食作用、在觀賞植物與組織[15]。多效唑處理柑橘果實降低貯藏腐爛雖有一定的試驗研究[16-17]，但其原因是殺菌作用或是誘導抗病的結果未見相關報道。本研究以具1cm2傷口的采后沙田柚果為供試果，多效唑處理、室溫貯藏，探索其對沙田柚果實的誘導抗病性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從廣東梅州市梅江區沙田柚果園采摘成熟沙田柚果實，挑選果實大小相對一致、果面無明顯機械傷、單果重約1.250kg的果實為供試。

95%多效唑(paclobutrazol，分析純) 江蘇建農農藥化工有限公司；無水乙醇(分析純) 廣州化學試劑廠；50%多菌靈可濕性粉劑(wet Carbendazim powder) 江蘇藍豐生物化工股份有限公司；2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 四川農化股份有限公司；15%綠色南方 珠海綠色南方保鮮總公司。

1.2 儀器與設備

YD-1508R Ⅲ冷凍切片機 金華市益迪醫療設備廠；BH-2光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 供試果人造傷口

每個供試果實表面的中部分上、下2層分別切約1.0cm2的傷口各5個，深度以將表皮的除油孢皮層削掉、白皮層露出為止，同層傷口間的間距基本一致。

1.3.2 處理與貯藏觀察

1.3.2.1 處理設置

多效唑以 0.4(T1)、0.7(T2)、1.0(T3)、1.3(T4)、1.6mmol/L(T5)分別處理供試果，另設綠色南方500倍液(CK1)處理、50%多菌靈500倍液＋1.0mmol/L 2,4-D(CK2)處理、傷果不經任何處理(CK3)及無傷果不經任何處理對照(CK4)。

1.3.2.2 處理方法

多效唑及2,4-D先以少量無水乙醇溶解，再用自來水定容，將供試果實在溶液內浸泡1min后取出，室內晾干，預貯7d后單獨聚乙烯薄膜袋包果，室溫貯藏。每處理3次重復，每重復處理40個供試果。

1.4 實驗觀察

1.4.1 貯期果實表面變化

貯藏期間肉眼觀察處理果實的傷口與鄰近表面顏色的變化、傷口表面霉菌的生長情況，用手指輕壓傷口表面感知組織硬度的變化。

1.4.2 柚果皮組織切片觀察

果實貯藏90d時，橫切果實傷口觀察傷口下白皮層顏色的變化；取小塊帶傷口的果皮，冰凍切片機切片、切片厚度20μm，將切片置于蘇丹Ⅲ染液制成臨時裝片，顯微觀察組織結構。

1.4.3 貯藏果傷口感染率實驗

貯藏果實每隔5d記載1次傷口腐果病菌侵染情況，凡傷口表面出現明顯的病原菌菌絲或組織解體松軟，記為已受病原菌感染，否則記為未感染，觀察周期30d。

1.4.4 貯藏果實感染率實驗

室溫貯藏的果實每隔10d觀察1次腐果數，凡果實出現侵染病癥，不論病斑面積大小均記為腐果，周期90d。

1.4.5 數據分析

以SPSS 13.0進行數據統計分析，并進行差異顯著性測定(P＜0.05，P＜0.01)。

2 結果與分析

2.1 多效唑處理沙田柚傷果的表觀特征

2.1.1 果皮傷口邊緣顏色的變化

多效唑處理傷果貯藏5d后，切口邊緣向外10mm以內的正常果皮顏色開始由原橙黃色轉為淺綠色，約20d后綠色又漸漸消退，變至與正常果表皮一致顏色。綠色南方處理傷口附近稍轉綠現象，空白對照果實傷口外緣未見轉綠現象(圖1)。傷口邊緣未受傷害的組織變綠，表明多效唑處理使傷口邊緣組織的生命活力明顯增強，而對距傷口邊緣較遠的未受傷部分組織的生命活力無不明顯影響。

圖1 多效唑處理果實初期照片Fig.1 Green edge of the wounded fruits treated with paclobutrazol

2.1.2 果皮傷口表面顏色的變化

多效唑處理果實預貯時傷口表面初期顯灰白色，很快轉為橙黃色，且微顯綠色。隨貯藏時間延長，傷口表面顏色逐漸轉為紅褐色，貯藏約3周后顏色不再因時間而加深，亦不因貯藏時間延長而褪色(圖2)。綠色南方處理的果實貯藏前期傷口表面顏色變化不明顯(圖3)。預貯期中空白對照CK3傷口表面的白皮層出現干縮、顏色灰白，且很快腐爛，未見果實傷口的褐變現象。

圖2 轉為褐色的多效唑處理沙田柚果實傷口照片Fig.2 Browning of the wounded fruits treated with paclobutrazol during the storage

圖3 未褐變的綠色南方處理沙田柚果實傷口照片Fig.3 Wounds without browning in the fruits treated with Green South

沙田柚果實經多效唑處理后，貯藏初期的生命活力增強，加之果皮中存貯養分較多，從而合成了大量酚類物質，氧化后使傷口表面顯褐色。木質素是一類復雜的酚類聚合物，分子中存在相當數量的酚羥基與植物的抗病性等具有相關性[18]，多效唑誘導果實傷口表面產生的酚類、氧化為紅色的醌類對貯藏初期有效防止果腐菌侵染具有重要作用。

2.1.3 處理果傷口表面的腐生菌

圖4 多效唑處理沙田柚果實傷口表面腐生菌照片Fig.4 Saprophytic fungi on the wounded surface of the fruits treated with paclobutrazol

圖5 綠色南方處理沙田柚果實傷口表面腐生菌照片Fig.5 Saprophytic fungi on the wounded surface of the fruits treated with Green South

目前報道的水果采后誘導抗病性是使處理的物質組織內產生抗菌次生代謝產物或防御酶抑制病原菌的危害[5-14]，具有廣譜性。若貯藏的時間較長，貯藏后期果實產生直接殺死微生物的物質已甚微或喪失，腐生菌就可在傷口表面滋生。

2.1.4 傷口組織硬度的變化

多效唑處理沙田柚傷果，貯藏期中傷口表面粗糙、凹凸不平，有小的孔穴(圖6)。手指輕壓傷口的果皮組織感覺較硬、不凹陷。傷口部位組織經多效唑刺激細胞內合成大量的木質素、沉積于細胞壁，薄壁細胞木質素逐漸累積使傷口表面細胞木栓化而變硬、愈合，對防止病菌的侵染具有屏障作用。處理果實的無傷口部位果皮、無傷對照果實的果皮均較松軟、具有彈性。

圖6 傷口表面凹凸不平的多效唑處理沙田柚果實照片Fig.6 Uneven surface of the wounds in the fruits treated with paclobutrazol

2.2 果皮傷口組織結構的變化

2.2.1 處理果實傷口剖面

圖7 多效唑處理沙田柚果實橫剖面照片Fig.7 Transverse section of the fruits treated with paclobutrazol and the browning of white cortex below the wounds

多效唑處理果實室溫貯藏90d時從傷口中部橫向剖開，發現傷口下及切口鄰近的白皮層組織均為紅褐色，褐變的范圍為切口向內縱向延伸5mm以內。果實表面傷口較深，則傷口下白皮層組織褐變向內擴展的范圍較大，切口橫向褐變的范圍多為2～3mm(圖7)。表明多效唑對處理果實生命活力的影響僅限于傷口附近的果皮組織。

2.2.2 傷口組織結構顯微觀察

多效唑處理果實室溫貯藏90d時從傷口中部橫向剖開，發現傷口下及切口鄰近的白皮層組織均為紅褐色，褐變的范圍為切口向內縱向延伸5mm以內。果實表面傷口較深的，則傷口下白皮層組織褐變向內擴展的范圍較大，切口橫向褐變的范圍多為2～3mm(圖7)。表明多效唑對處理果實生命活力的影響僅限于傷口附近的果皮組織。2.2.3 處理果實傷口組織切片觀察

多效唑處理的果皮切片顯微觀察，發現傷口下的白皮層細胞壁較厚，尤其是傷口表層細胞壁加厚特別顯著，相鄰細胞間相互融合成一整體，已失去細胞輪廓。細胞壁加厚突出部分的顏色深，且冰凍切片時易于碎裂(圖8)。切口鄰近的細胞壁亦有一定加厚，且細胞內存在著許多顆粒狀沉積物。空白對照無傷果的切片見上述現象，其細胞較大、排列疏松、透明，白皮層內的導管染色很深，與多效唑處理果實傷口表層的顏色一致(圖 9)。

圖9 未經處理無傷沙田柚果表皮組織切片照片Fig.9 Peel section of the fruits without wounds and without treatment

木質素從細胞次生壁外側逐漸向內壁沉積，主要沉積在導管細胞壁[19-20]。多效唑處理的果實因木質素的不斷沉積最終充滿整個細胞腔，相鄰細胞彼此連成一整體后，使傷口封閉愈合，染色與導管染色效果一致。另外，木栓化細胞鄰近的薄壁細胞壁內的顆粒狀物質也可能系木質素沉積物。

經誘導處理的果實在較短的貯藏期內傷口表層木栓化愈合，從而形成保護屏障，病原菌再不能通過傷口侵入果實內部，可有效抑制貯藏后期的果實腐爛。

2.3 多效唑對沙田柚傷果的貯藏防腐效應

2.3.1 對傷口感染的抑制作用

表1 沙田柚果實室溫貯藏傷口感染率Table 1 Infection rate of Shatian pomelo fruits during the storage at room temperature %

多效唑處理的沙田柚傷果貯藏前期傷口受病菌侵染結果見表1。由表1看出，所有5種多效唑不同劑量處理的傷口感染率與空白傷口對照的感染率極顯著的差異，其中T4、T3處理的感染率最低，30d傷口的感染率分別為4.38%及3.13%，與綠色南方(CK1)處理的傷口感染率無顯著差異，但顯著低于2,4-D＋多菌靈處理(CK2)。表明多效處理貯藏期30d內對抑制病原菌對傷口侵染具有顯著作用。

2.3.2 對傷果的貯藏防腐作用

沙田柚采后造傷果經多效唑處理后，腐爛率最低的處理1.0mmol/L及1.3mmol/L，分別為13.3%和14.4%，較綠色南方(CK1)和無傷果對照(CK4)無顯著差異。結果表明其對沙田柚人造傷果的防腐效果與綠色南方500倍液處理的效果相當(表2)。多效唑其余3個劑量處理果實腐爛率雖顯著高于上述幾個處理，但仍顯著低于傷果空白對照(CK3)和以2,4-D＋多菌靈處理(CK2)。

綠色南方(CK1)是我國華南地區目前廣泛用于柚果實采后處理貯藏的防腐保鮮劑，多效唑處理后傷口感染率與傷果腐果率與其相當，表明其在沙田柚的采后防腐方面具有極大的應用潛力。而CK2雖是國內橙類果實采后防腐沿用長達數十年的保鮮劑，卻對沙田柚傷口抗感染的效果較差。

表2 沙田柚傷果貯藏中的腐果率Table 2 Rotten fruit rate of Shatian pomelo fruits during storage at room temperature %

3 討論與結論

采后沙田柚具有較強的誘導抗病潛力。本研究以多效唑處理采后傷果，室溫貯藏前期果皮傷口邊緣的正常果皮顏色變綠，而后逐漸褪綠轉為正常果皮的橙黃色，傷口表面逐漸變為紅色，處理果實貯藏期中受病原菌的感染顯著降低，表現出良好誘導的防腐效果。誘導抗病性的強弱與使用誘導因子的種類與劑量、果實生命活力的強弱以及處理后果實的溫、濕度[21]等都相關，在前期的實驗探索中采用包括水楊酸在內的多種化學因子進行初步篩選后，結果沙田柚以多效唑處理抗病菌侵染的效果為最佳。

多效唑具誘導沙田柚傷口愈合的作用。一般的誘導抗病性是處理后的植物組織直接產生作用于病原菌的防御酶，如β-1,3-葡聚糖苷酶和幾丁質酶等[22-23]，或產生具抗菌作用的次生代謝產物等，此類型的誘導抗病作用將隨果實的生命活力下降而減弱、甚至完全喪失，對貯藏期較長果實貯藏防腐的生產應用有一定的局限。沙田柚采后經多效唑處理使傷口及其附近組織大量合成木質素多酚類物質，且傷口表層細胞木栓化，一定時間內使采后果實傷口愈合消除了病原菌侵染的主要途徑，即使貯藏期較長、組織的抗病性下降，貯藏果實也不易受感染而腐爛。

多效唑處理可誘導采后沙田柚產生抗菌次生代謝產物。多效唑處理后傷口表面變紅，而空白對照無明顯變化，對照表明果實處理后誘導產生了具殺菌活性的酚類，酚氧化而為紅色、殺菌作用更強的醌，而且酚類物質是木質素合成的前體物質，在傷口處木質素的累積而使傷口愈合。但多效唑誘導沙田柚的抗病次生代謝產物的具體種類，以及多效唑處理是否也同時誘導沙田柚產生幾丁質酶等抗菌蛋白，有待進一步研究。

多效唑處理采后沙田柚果實的傷口愈合系多效唑增強木質素代謝的結果，而代謝的增強會增大采后果實的營養消耗，貯藏果實品質的降低。但多效唑處理誘導的沙田柚抗病反應僅發生于傷口及附近有限的區域內，大面積的正常果皮與果肉都未出現顏色變深、白皮層細胞壁增厚，白皮層細胞內也未見顆粒物存在，而且柚的白皮層、組織內養分豐富，因而處理果實室溫貯藏90d時的果汁率、果溶性固形物等理化分析結果與綠色南方無顯著差異，多效唑處理對貯藏果實的品質尚未見不良影響。

多效唑為低毒農藥，原藥大鼠急性口服LD50為2000mg/kg，無三致效應[24]。目前國內多效唑最大殘留限量，花生(仁)、小麥等多為0.50mg/kg[25-26]。沙田柚商品果單果一般質量約1250g，其比表面積遠小于橙類、梨及蘋果等，相同濃度的農藥短時浸果處理比表面積小的果實后，農藥可能的殘留量遠小于比表面積大的果實的殘留量，本實驗以0.7mmol/L及1.0mmol/L的多效唑處理時間1min以內，按質量計算處理果實的初始著藥量就小于0.5mg/kg，處理的沙田柚貯藏防腐不僅符合綠色果品要求，而且誘導傷口愈合的抗病性系屏蔽保護作用，病原菌不會因長時間使用而產生抗性，也不致長時間使用后而增大劑量。

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Disease-resistant Effect of Paclobutrazol Induction on Wounded Fruits of Postharvest Shatian Pomelo

ZHANG Jing，DIAO Jun-ming，HUANG Si-mei，DIAO Shu-ping
(College of Life Science, Jiaying University, Meizhou 514015, China)

In order to improve disease-resistant capability of postharvest Shatian pomelo during storage at room temperature,the paclobutrazol was used to treat wounded fruits for evaluating the disease-resistant response due to the induction of paclobutrazol. Postharvest Shatian pomelo was cut 10 wounds with a size of 1 cm2, and then immersed in paclobutrazol solution for 1 min. The treated fruits was wrapped with PVC film and stored at room temperature after 7-day pre-storage. During storage,the color of normal peel adjacent to the wounds was changed from orange to light green at the early stage of the storage, and gradually recovered to orange. However, the wounded surface was changed from white to light green at the beginning of storage,and then to brown as the extension of storage time. The hardness of the wounds exhibited a gradual increase and the white cortex below the wounds was changed to brown. Cell wall of the wound surface layer was become thinker and grains in the white cortex of cells near to the wounds were observed. The infection rate of wounded fruits treated with paclobutrazol solution at the concentration of 1.0 mmol/L paclobutrazol was 13.33% after 90-day storage. Therefore, paclobutrazol has obvious diseaseresistance effect on postharvest Shatian pomelo fruits through the induction of paclobutrazol.

Shatian pomelo；postharvest；paclobutrazol；induced disease resistance

S666.3；TS255.3

A

1002-6630(2010)20-0453-06

2010-06-16

張鏡(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為天然產物與應用微生物。E-mail：zhangcqf@jyu.edu.cn