灰樹花在米糠培養基上固態發酵產多糖研究

劉偉民，徐立平，郭春梅，楊鎖華，張 建，趙杰文

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013)

灰樹花在米糠培養基上固態發酵產多糖研究

劉偉民，徐立平，郭春梅，楊鎖華，張 建，趙杰文

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013)

為高效利用稻谷加工副產品米糠并擬在固態發酵設備中發酵生產多糖保健食品，以米糠為基礎培養基，對灰樹花固態發酵米糠產多糖條件進行探索。針對定量米糠，選取水分、蛋白胨、葡萄糖和pH值影響因素，以總多糖含量為評價指標進行試驗，按L16(45)的正交試驗方案得到優化培養基，并進一步通過單因素試驗選擇得到較優的固態發酵工藝條件。結果表明：優化固態培養基組成為原始米糠(水分為65%，按原始米糠質量計)、蛋白胨0.5%、葡萄糖4%、pH5.5、裝樣量20g/250mL三角瓶，發酵條件為：接種量10%、培養溫度25℃、搖床轉速170r/min、培養時間11d，多糖得率以米糠為標準計算，可達4.52%。用SPSS軟件處理數據，得到表征多糖產量和培養基成分關系的回歸方程。

灰樹花；米糠培養基；固態發酵；灰樹花多糖；回歸模型

灰樹花(Grifola frondosa)是一種珍稀的食、藥兼用真菌[1-3]，它富含維生素、真菌多糖，并可用于富集鋅、鈣、磷、鐵、硒等多種對人體有益的礦物質，因而可以用于生產健康食品和醫療保健品[4-8]。固態發酵具有對環境污染小，單位體積內獲得產物多等優點，有其應用價值。本單位自主研發了轉鼓式固態發酵設備，具有良好的效果，希望進一步開發出適用工藝。米糠作為稻谷加工過程中的副產品[9-10]，將其加入固態發酵培養基中，使其在灰樹花產多糖和富集微量元素的過程中得到利用，使工廠化固態發酵在節約土地使用和提高生產效率的同時，降低生產成本，本研究具有實用意義[11-15]。采用多項式或線性回歸方法建立固態發酵模型，可更清楚揭示研究目標和影響因素之間的定量關系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

灰樹花菌種為實驗室保藏菌種；米糠由鎮江市米廠提供；所用試劑均為分析純。

HANGPING JA2003電子天平 上海儀器儀表廠；SHJ CA-480-Ⅱ超凈工作臺 上海匯龍公司；數顯生化培養箱 常州國華電器有限公司；DH2-D冷凍恒溫振蕩器 江蘇太倉試驗設備廠；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；WFJ7200可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固體培養基的配制

稱取定量米糠放入250mL的三角燒瓶中，按米糠的質量為基準計算出加入的水分和外加的碳源、氮源后搖勻，0.1MPa高壓滅菌30min。原始米糠中所含米糠多糖經測定含量較低，未做提取，供灰樹花在生長中作為營養物質使用并轉化掉。

1.2.2 培養方法

培養基單因素試驗，250mL三角燒瓶中裝入60%水分的含15g原始米糠的固體培養基，25℃、搖床轉速150r/min、10%的接種量、培養7d。

正交試驗的原始米糠裝樣量4.5g、接種量10%、轉速150r/min、溫度25℃、發酵時間7d。

發酵工藝條件的單因素試驗參照培養基單因素試驗各條件進行。某因素變動時，其他條件不變。培養基為優化培養基。

1.2.3 多糖提取[11-14,16-18]及含量測定

將發酵后的米糠研磨，沸水提取6h，2400r/min離心20min，加耐高溫淀粉酶除淀粉，降溫至60℃，糖化酶除糊精，冷卻，調節等電點去除蛋白質，3200r/min離心20min，取上清液用乙醇沉淀，離心，得沉淀，苯酚-硫酸法測定總多糖含量。加淀粉酶去除可能存在的少量淀粉，將其降解成糊精和麥芽糖，再在糖化酶的作用下降解成葡萄糖，溶于乙醇被除去。

式中：m為樣品中原始米糠質量；m1為多糖質量。

1.3 試驗設計

根據水分(50%～75%)、葡萄糖(0～6%)、蛋白胨(0～1.5%)和pH值(3～6)這4個因素進行單因素試驗結果，進行L16(45)的正交試驗，按照正交設計“實用主義”的原則，暫不考慮交互作用，是否有交互作用由回歸方程作基本的解釋。其因素水平如表1所示，原始米糠定量為4.5g，百分比按原始米糠質量計算。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結果與分析

2.1 培養基的單因素試驗結果

2.1.1 碳源對固態發酵的影響

2.1.1.1 外加不同碳源對固態發酵的影響

米糠中含有碳源，但是量未必足夠，外加一定的碳源會有助于灰樹花的生長。試驗以60%的水分含量米糠固態培養基分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉及空白試驗作對照，結果如圖1所示。

圖1 碳源對多糖含量的影響Fig.1 Effect of carbon resource on the yield of grifolan

由圖1可知，外加碳源對灰樹花在米糠上進行固態發酵有一定的影響，外加以上不同的碳源后都比空白的多糖含量有所增加，其中葡萄糖＞淀粉＞乳糖＞蔗糖。故后續研究選用葡萄糖作為外加碳源。

2.1.1.2 葡萄糖添加量對固態發酵的影響

以60%水分含量米糠固體培養基分別加入質量分數為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的葡萄糖，結果如圖2所示。

圖2 葡萄糖添加量對多糖產量的影響Fig.2 Effect of glucose content on yield of grifolans

由圖2可知，隨著葡萄糖含量量的增加，多糖的含量也隨之增加，當葡萄糖添加量為4%時達到最大，當添加量大于4%時多糖的含量有所減少。為節省生產耗費，可取較小的添加量。

2.1.2 氮源對固態發酵的影響

2.1.2.1 外加不同氮源對固態發酵的影響

氮源的不同形式是影響灰樹花生長的重要因素之一。灰樹花有自己獨特的酶系，對不同的氮源有不同的利用程度。在60%水分含量，4%葡萄糖米糠固體培養基中分別加入0.5%的蛋白胨、牛肉膏和酵母膏作為外加氮源并與空白對照比較，結果如圖3所示。

圖3 氮源對多糖產量的影響Fig.3 Effect of nitrogen resource on the yield of grifolan

由圖3可知，外加的氮源中，以蛋白胨對米糠固態發酵的影響為最大，它們的影響大小依次為蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏，故本研究采用蛋白胨為外加氮源。未考慮其他氮源，原因是試驗還是初步性的，首先考慮能生長，將來再做富含氮如麩皮便宜氮源及無機氮源的深入研究。

2.1.2.2 氮源添加量對固態發酵的影響

在60%的水分和4%葡萄糖的米糠固體培養基中分別加入質量百分數為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%的蛋白胨，結果如圖4所示。

圖4 蛋白胨添加量對多糖產量的影響Fig.4 Effect of peptone content on the yield of grifolan

由圖4可知，隨著蛋白胨添加量的增加，米糠固態培養基的總多糖都隨之增加，達到1%以后，多糖的增加幅度不大。

2.1.3 水分對固態發酵的影響

在4%葡萄糖、1%蛋白胨的米糠固體培養基上，選用質量分數50%、55%、60%、65%、70%、75%的水分含量進行試驗，結果如圖5所示。

由圖5可知，水分含量在60%時灰樹花在米糠上生長最旺盛。水分含量太低不利于酶活和營養物質的傳遞，然而水分含量太高時不利于空氣的流動。

圖5 水分含量對多糖含量的影響Fig.5 Effect of water content on the yield of grifolan

2.1.4 pH值對發酵的影響

將4%葡萄糖、1%蛋白胨、60%水分的米糠固態培養基的起始pH值分別調至為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0進行試驗，結果如圖6所示。

圖6 pH值對多糖含量的影響Fig.6 Effect of pH on the yield of grifolan

由圖6可知，當pH值達到4.5時，多糖得率達到最大，pH值過大或者過小，都不利于灰樹花在米糠固態培養基上生長。

2.2 培養基優化正交試驗結果與分析

2.2.1 正交試驗結果

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

按L16(45)方案，在150r/min，25℃條件下進行實驗，發酵7d后多糖含量如表2所示。

2.2.2 極差分析

以多糖含量為指標，對正交試驗結果進行極差分析，結果如表3所示。

表3 多糖含量的極差分析結果Table 3 Rang analysis of orthogonal experiments for the yield of grifolan

由表3可知，4種因素對發酵的影響大小依次為A＞D＞B＞C，最佳培養基的配方為A4B4C2D3，即水分含量65%、葡萄糖添加量4%、蛋白胨添加量0.5%、pH5.5。

2.2.3 方差分析

以多糖含量為評價指標，對正交試驗結果進行方差分析，結果如表4所示。

表4 多糖含量的極差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for the yield of grifola

由表4可知，水分和pH值對多糖含量的影響高度顯著，葡萄糖對多糖含量的影響顯著，蛋白胨的影響不顯著，被合并誤差，故在指定的水平范圍內，蛋白胨含量的變化可不考慮。

2.3 固態發酵工藝條件的選擇結果

2.3.1 裝樣量對固態發酵的影響

由圖7可知，裝樣量較少時，培養基中含氧量較大，故多糖的得率會較大，但得到的總多糖較低，考慮生產效率選擇20g米糠裝料量。裝樣量超過20g時，培養基中氧含量少，CO2不易排出，多糖得率總體趨勢變低。

圖7 裝樣量對多糖含量的影響Fig.7 Effect of flask-filling volume on the yield of grifolan

2.3.2 接種量對固態發酵的影響

圖8 接種量對多糖含量的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the yield of grifolan

由圖8可知，隨著接種量的增加，多糖含量也隨之增加。當接種量超過10%時，隨著接種量的增加，水分也隨之增加，使得灰樹花生長受到抑制。綜合考慮接種量和含水率，選擇接種量10%。

2.3.3 發酵時間對灰樹花固態發酵的影響

圖9 發酵時間對多糖含量的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the yield of grifolan

由圖9可知，隨著生長時間增加，發酵后的固態米糠培養基的多糖含量有所增加，后期變緩。從經濟的角度考慮，選擇11d作為發酵時間。

2.3.4 溫度對灰樹花深層固態發酵的影響

由圖10可知，隨著溫度的增大，灰樹花的生長增加，在溫度達到25℃時，灰樹花生長的速度最快。當溫度大于25℃時，灰樹花長的速度逐漸減緩。故選擇25℃作為發酵溫度。

圖10 溫度對多糖含量的影響

Fig.10 Effect of fermentation temperature on the yield of grifolan

2.3.5 轉速對灰樹花深層固態發酵的影響

圖11 轉速對多糖含量的影響

Fig.11 Effect of rotation speed on the yield of grifolan

由圖11可知，隨著轉速的增加，多糖含量也隨之增加。當轉速超過170r/min時，隨著轉速的增加，多糖含量增加不多，為了降低機械功率的輸出，選取170 r/min作為發酵過程中的搖床轉速。

2.3.6 局部尋優的發酵工藝條件

根據以上試驗的結果，采用局部尋優法，選擇較好的發酵工藝條件是：裝樣量250mL三角瓶裝入20g米糠為基礎的優化培養基，10%接種量、溫度25℃、搖床轉速170r/min，培養時間11d。以優化培養基在所選較優的工藝條件下進行固態發酵驗證實驗，多糖含量(占米糠質量的百分數)為4.52%。

2.4 多糖含量和培養基成分關系回歸模型的求取

為求取固態發酵米糠培養基得到的灰樹花多糖含量和培養基組成關系的模型，利用正交試驗數據，使用SPSS軟件選擇二次多項式回歸模型進行求取。得到總多糖含量與水分含量A和葡萄糖含量B(其他因素利用SPSS回歸計算得到的變量系數的t檢驗結果，判斷無顯著性而剔除)的回歸關系式為：

擬合的相關系數R為0.826，決定系數R2為0.682，可以認為數據擬合優度較好。對方程的顯著性F值為5.907，P值為0.009，故回歸模型高度顯著。正交試驗設計時首先假定沒有交互作用，而回歸模型說明有交互作用，所以正交試驗的假定有局限性，但如考慮交互作用，需選用更大的正交表，為克服這一不足，可考慮采用求回歸模型的方法進一步考察目標函數和變量之間的可能關系。

3 結 論

通過對影響培養基的葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、起始水分和pH值4個因素的探索，并且根據單因素試驗的結果進行正交試驗，得到優化的米糠固體培養基配方。

對固體培養條件進行研究，得到較優的搖瓶條件。多糖得率以米糠為標準計算，可達4.52%。

采用SPSS軟件，對正交試驗數據進行回歸計算，得到了總多糖與水分含量和葡萄糖含量的回歸關系式。

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Solid Fermentation ofGrifola frondosain Rice Bran Medium for Grifolan Production

LIU Wei-min，XU Li-ping，GUO Chun-mei，YANG Suo-hua，ZHANG Jian，ZHAO Jie-wen
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to effectively exploit rice bran for preparing health food containing polysaccharides through mimic solid fermentation, rice bran was used as the culture medium matrix to explore the effects of water content, peptone, glucose and pH on solid fermentation ofGrifola frondosa. The optimal culture medium and fermentation conditions were explored by single factor and orthogonal experiments on the basis of grifolan productivity. Results indicated that the optimal medium formula was composed of rice bran as solid culture medium matrix with 65% water, 0.5% peptone, 4% glucose (by mass of rice bran) and pH 5.5. The optimal fermentation conditions were 20 g rice bran matrix in a 250 mL fermentation flask, inoculation amount of 10%,fermentation temperature of 25 ℃, rotation speed of 170 r/min and fermentation time of 11 days. The yield of grifolan was 4.52% under the optimal conditions. By calculating with SPSS software, a regression model of total grifolan was achieved.

Grifola；rice bran medium；solid fermentation；grifolan；regression model

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0238-05

2010-09-21

江蘇省社會發展科技計劃項目(BS2006037)；江蘇鎮江市農業支撐科技項目(NY2008043)

劉偉民(1964—)，男，教授，博士研究生，主要從事農產品加工及貯藏研究。E-mail：liuwmwu@ujs.edu.cn