堿性蛋白酶限制性水解對高溫菜籽粕蛋白功能性質的影響

王素雅，劉 勝，鞠興榮，嚴梅榮，袁 建

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003)

堿性蛋白酶限制性水解對高溫菜籽粕蛋白功能性質的影響

王素雅，劉 勝，鞠興榮，嚴梅榮，袁 建

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003)

為改善高溫菜籽粕蛋白質的功能性質，用堿性蛋白酶對其進行限制性水解，并研究不同水解度(DH)高溫菜籽粕蛋白功能性質及相對分子質量分布。結果表明：堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度、乳化性和吸油性均有所改善，其中溶解度隨水解度增加而增加，pH7.0時DH為10%的高溫菜籽粕蛋白的溶解度達63.82%，是原蛋白溶解度的2.1倍；DH為2.0%的水解蛋白乳化性最好，pH6.0和pH8.0時乳化指數分別為0.43和0.49，比原蛋白乳化指數分別高0.13和0.11；DH為8%的水解蛋白吸油性最好，為4.39g/g。水解后高溫菜籽粕蛋白的某些功能性質與其相對分子質量分布有一定的關系，需控制高溫菜籽粕蛋白水解度以獲得某種良好的功能性質。

菜籽粕蛋白；堿性蛋白酶；水解度；功能性質

植物蛋白質改性的方法有酶法、化學法、物理法及生物轉基因法等，其中酶法與化學法最常用。與化學法改性相比，酶法改性具有許多優點，如條件溫和、效率高，不破壞氨基酸結構，產生有害物質的可能性小，安全性高等[1]。蛋白質限制性水解改性是指利用蛋白酶水解，使蛋白質分子的空間結構和理化性質發生改變[2]，從而提高蛋白質營養價值、改善各種功能特性并擴大蛋白質應用領域。然而，過度酶解會造成某些功能特性減弱甚至完全喪失[3]。已有的研究表明，蛋白質的分子質量大小(即肽鏈長短)與功能特性改善有密切關系[4-5]。因此限制性水解是獲得良好性能蛋白質的重要基礎。

工業榨油后，菜籽粕中的蛋白質由于高溫、有機溶劑等作用而功能性質劣化，因此，采取適宜方法對高溫菜籽粕蛋白改性，是提高菜籽粕蛋白利用率的關鍵。目前，國內外有關酶法改善高溫菜籽粕蛋白功能性質的研究較少，因此，本實驗用堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白，探討不同水解度高溫菜籽粕蛋白的功能性質及相對分子質量變化，以期為高溫菜籽粕蛋白的進一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫菜籽粕蛋白 自制；高溫菜籽粕 南京隆盛油脂有限公司；金龍魚菜籽色拉油(精煉一級) 益江(張家港)糧油工業有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-25型pH計、722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；臺式離心機TDL-5-A 上海安亭科學儀器廠；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；501型超級恒溫器 上海試驗儀器廠有限公司；FJ200-S數顯高速分散均質機 上海標本模型廠；AIPHAI-4LD PLUO真空冷凍干燥機 德國Christ公司；JJ-1精密定時電動攪拌器 江蘇省金壇市榮華制造有限公司；AKTA purifier全自動蛋白質分析純化儀 美國GE Healcare集團。

1.3 方法

1.3.1 高溫菜籽粕蛋白的提取

以高溫菜籽粕為原料，采用淀粉酶與堿(稀NaOH溶液)提取相結合的方法提取蛋白。淀粉酶作用條件為加酶量2.5%，料液比1:20(g/mL)，pH7.0，50℃反應3h；之后用堿提取，其作用條件為料液比1:12(g/mL)，pH10.0，55℃提取2h。4000r/min離心20min，上清液用稀酸調至pH4.0使蛋白質等電點沉淀，然后70%乙醇溶液脫色處理后凍干。提取的菜籽粕蛋白中蛋白質含量為78.44%，硫代葡萄糖苷含量為0.17mg/g。

1.3.2 堿性蛋白酶限制性水解高溫菜籽粕蛋白

石油工業部非常重視這項工程。石油部領導明確提出：“用第一流的施工水平，第一流的工程質量，為第一流的城市服務。”并要求全部工程須經超聲波探傷檢查和20%的X射線檢查。

將一定量的高溫菜籽粕蛋白配制成相應質量濃度的溶液，用1mol/L的NaOH溶液調節至相應pH值與溫度，用堿性蛋白酶進行水解，其間不斷滴加0.5mol/L NaOH溶液保持反應體系pH值穩定。當達到預期水解度時，將反應液置于90℃保溫滅酶。冷凍干燥后即得不同水解度的改性高溫菜籽粕蛋白。

1.3.3 高溫菜籽粕蛋白水解度的測定

采用pH-stat法測水解度(DH)[6]。DH定義為蛋白質中被水解的肽鍵的比例，水解度計算如式(1)。

式中：V為消耗堿的體積/mL；c為標準NaOH的濃度/(mol/L)；mp為蛋白質的質量/g；htot為每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數(取7.8mmol/g)；α為樣品分離蛋白氨基平均解離度。

1.3.4 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白溶解度的測定

采用雙縮脲法[7]。準確稱取0.20g樣品溶于20mL水中，分別調節pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室溫攪拌30min，然后4000r/min離心20min。采用雙縮法測定上清液蛋白質含量，并計算高溫菜籽粕蛋白的溶解度。

1.3.5 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白乳化性及乳化穩定性的測定

采用濁度法[8]。稱取一定量樣品溶解于不同pH值緩沖液中配成質量分數1.0%的蛋白溶液，室溫磁力攪拌30min后，加入5.0mL大豆油，以10000r/min均質60s，立即從底部吸取100μL乳濁液與10.0mL 0.1% SDS溶液混勻，于波長500nm處測定吸光度A0，此值記為乳化活性(EA)。10min后重新從靜置的乳濁液底部取樣測定吸光度At。按式(2)計算乳化穩定性(ES)。式中：△t為兩次測定乳化活性的時間間隔/min；本實驗中該值為10min。

1.3.6 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白吸油性的測定[9]取0.50g蛋白樣品置于10mL離心管中，加入5.0mL大豆油，攪勻后置于40℃水浴中保溫30min，然后4000r/min離心30min，傾去上層未吸附的大豆油，稱蛋白質量，計算每克蛋白質樣品的吸油性。

式中：m0為蛋白質樣品質量/g；m為蛋白質吸油后質量/g。

1.3.7 限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布

采用凝膠排阻層析色譜法[10]。KTA purifier全自動層析系統，分離柱為Superose12 10/300 GL(10mm×300mm)預裝柱，進樣體積為500μL，洗脫液為0.15mol/L NaCl，50mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液，洗脫流速0.5mL/min，檢測波長為215nm。相對分子質量標準品為牛血清白蛋白(Mr67000)、細胞色素 (Mr12700)、鈷胺酰胺(VB12，Mr1355)、Gly-Gly-Tyr-Arg(Mr451.48)。

2 結果與分析

2.1 限制性水解對高溫菜籽粕蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質功能性質的基礎，具有良好溶解性能的蛋白質才可能擁有優良的乳化性、起泡性和凝膠性，適于食品工業加工利用。高溫菜籽粕蛋白質溶解性差，直接影響到高溫菜籽粕蛋白的應用，而限制性水解可有效提高高溫菜籽粕蛋白的溶解性。

圖1 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的溶解度Fig.1 pH dependence of solubility of rapeseed thermoresistant protein with different DHs

由圖1可知，高溫菜籽粕蛋白及其限制性水解物的等電點均在pH4.0附近，其中高溫菜籽粕蛋白溶解性差，pH4.0時溶解度僅為4.77%。而經堿性蛋白酶水解后其溶解度不斷提高，當DH為10%時，水解高溫高溫菜籽粕蛋白溶解度達34.44%，比原蛋白提高了6倍。在pH7.0時，DH為10%的水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度達63.82%，是原高溫菜籽粕蛋白的2.1倍。水解高溫菜籽粕蛋白溶解度提高可能是由于多肽鏈斷裂并暴露出離子化的氨基和羧基，使分子極性增強，親水性增加[11-12]；同時，水解破壞了分子中疏水區域的結構，增加分子間相互排斥作用，提高了水解物在溶液中的分散穩定性，進而提高了蛋白質的溶解性[13]。

2.2 限制性水解對高溫菜籽粕蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

圖2 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的乳化性Fig.2 pH dependence of emulsifying capacity of rapeseed thermoresistant protein with DHs

由圖2可知，限制性水解前后高溫菜籽粕蛋白的乳化性均受pH值影響，在等電點附近乳化活性最低，偏離等電點則乳化活性提高，該結果與趙國華等[13]和Yin等[14]報道一致。不同水解度高溫菜籽粕蛋白乳化活性不同，其中DH為2%的水解高溫菜籽粕蛋白乳化活性最好，pH6.0、8.0時乳化活性別為0.43、0.49，比原蛋白分別高0.13、0.11。分析認為：制油過程使菜籽蛋白嚴重變性，溶解性降低，不能夠迅速擴散到油/水界面[15]。而限制水解后高溫菜籽粕蛋白溶解性增大，分子柔順性增加，利于蛋白質迅速擴散而降低油/水界面的自由能。同時多肽鏈電荷增加，靜電作用阻止了油滴聚集[16]，因此，限制性水解高溫菜籽粕蛋白乳化性得到一定程度改善。但隨著水解度不斷提高，多肽鏈中更多的極性基團外露，其降低界面自由能的能力下降，因此乳化活性降低。本實驗中限制性水解不能改善高溫菜籽粕蛋白的乳化穩定性，由圖3可知，高溫菜籽粕蛋白乳化穩定性最高，水解蛋白的乳化穩定性隨DH增大而降低。這可能是由于縮短的多肽鏈在油/水界面上的相互作用能力減弱，在界面上形成的黏彈性膜不能維持界面層平衡，乳化球易于破裂。

圖3 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的乳化穩定性Fig.3 pH dependence of emulsion stability of rapeseed thermoresistant protein with DHs

2.3 限制性水解對高溫菜籽粕蛋白吸油性的影響

圖4 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的吸油性Fig.4 Relationship between oil absorption capacity and DHs of rapeseed thermoresistant protein

本實驗限制性水解可有效改善高溫菜籽粕蛋白的吸油性，由圖4可知，DH為8%的高溫菜籽粕蛋白吸油性最佳，為4.39g/g，比原蛋白的1.53g/g提高約2.9倍。這可能是由于水解使蛋白分子內部的疏水基團暴露，吸油性顯著提高。但當水解度進一步增大時，多肽鏈極性增強，蛋白質吸附油滴的能力降低，吸油性又呈下降趨勢。

2.4 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布

圖5 酶解改性高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布曲線Fig.5 Molecular weight distribution curves of rapeseed thermoresistant protein with DHs

表1 不同水解度高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布Table 1 Molecular weight distribution of rapeseed thermoresistant protein with DHs

由圖5與表1可知，原蛋白質在凝膠層析色譜中出現4個峰，其中A峰占總峰面積的38.96%，B峰占17.76%，相對分子質量大于5000的大分子蛋白共占56.72%，說明原蛋白質以大分子為主。隨水解度的增加，堿性蛋白酶水解蛋白在凝膠層析中A峰面積減小，B峰消失，C峰面積增加，表明高相對分子質量蛋白逐漸減少，低相對分子質量蛋白逐漸增多。DH為2%的限制性水解高溫菜籽粕蛋白的C峰面積比例大幅增加，達到78.73%，A峰面積則下降至16.72%，說明小分子質量的寡肽比例相應增加。當DH為10%時，限制性水解高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量則以1500～5000的多肽為主，占峰面積的90%以上，此時水解高溫菜籽粕蛋白相對分子質量較小，肽鏈較短。高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布情況主要取決于水解度的高低，隨水解度提高，低相對分子質量小肽類物質逐漸增多，網狀結構遭到破壞，膨脹性降低，蛋白多聚體解聚，使得蛋白質的有序性增加，蛋白質的表觀體積減小，溶解性增加；另外，蛋白的降解使得肽類分子的離子基團增加，相互排斥性增強，這也使得蛋白的溶解性增加。而當DH為2%時，水解高溫菜籽粕蛋白可能處在一種適度松散的狀態，有利于分散到油/水界面上形成具有高度黏彈性的網絡膜，阻止油滴間的聚集，進而表現出較高的蛋白質乳化性；當高溫菜籽粕蛋白被進一步深度水解時，蛋白相對分子質量變小，多肽鏈過短，不能像高相對分子質量蛋白那樣伸展以形成具有高黏彈性的保護膜及降低油水界面的界面張力，從而導致乳化性能下降。所以有必要對蛋白質的水解度進行控制，保證其相對分子質量處于合理狀態，以取得較理想的功能性質。

3 結 論

3.1 采用堿性蛋白酶對高溫菜籽粕蛋白進行限制性水解改性后，水解高溫菜籽粕蛋白的溶解度隨水解度增加而增大，pH4.0時DH為10%水解蛋白溶解度比原蛋白提高了6倍，pH7.0時DH為10%水解蛋白的溶解度達63.82%；水解蛋白的乳化性和吸油性也都有所提高，DH為2%的水解蛋白乳化性最好，在pH6.0與pH8.0時乳化活性分別為0.43與0.49；DH為8%的水解蛋白吸油性最好，為4.39g/g，比原蛋白提高了近2.9倍，但所有改性蛋白的乳化穩定性并無改善。

3.2 采用凝膠排阻層析分析了限制性水解高溫菜籽粕蛋白的相對分子質量分布，表明蛋白的某些功能性質與相對分子質量分布有一定的關系。因此，需控制高溫菜籽粕蛋白水解度以獲得某種良好的功能性質。

[1] 沈輝, 王梅. 食品酶的應用[J]. 食品科學, 1996, 17(2): 3-7.

[2] LEE K A, KIM S H. SSGE and DEE, new peptides isolated from a soy protein hydrolysate that inhibit platelet aggregation[J]. Food Chem,2005, 90(3): 389-393.

[3] KUEHLER C A, STINE C M. Effect of enzymatic hydrolysis on some functional properties of whey protein[J]. Food Sci, 1974, 39: 379-82.

[4] DEESLIE W D, CHERYAN M. Fractionation of soy protein hydrolysates using ultrafiltration membranes[J]. Food Sci, 1991, 57: 411-413.

[5] 孫群, 闞健全, 趙國華, 等. 大豆肽特性及其在食品工業中應用[J].糧食與油脂, 2003(12): 11-13.

[6] ADLER-NISSEN J. Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. New York:Elsevier Applied Science Publishers, 1986: 116-124.

[7] 陳鈞輝, 李俊, 張太平, 等. 生物化學實驗[M]. 4版. 北京: 科學出版社, 2008: 63-64.

[8] PEARCE K N, KINSELLA J E. Emulsifying properties of proteins:Evaluation of a turbidimetric technique[J]. J Agri Food Chem, 1978, 26(3): 716-723.

[9] SINHA R, RADHA C. Whey protein hydrolysate: Functional properties,nutritional quality and utilization in beverage formulation[J]. Food Chem,2007, 101: 1484-1491.

[10] 鞠興榮, 何榮, 袁建, 等. 固態發酵生產菜籽肽菌種的篩選[J]. 食品科學, 2008, 29(12): 494-497.

[11] PUSKI G. Modification of functional properties of soy protein by proteolytic enzyme treatment[J]. Cereal Chem, 1975, 52(5): 655-664.

[12] MAHMOUD H I. Enzymatic hydrolysis of casein: Effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical properties[J]. Food Sci, 1992,57(5): 1223-1228.

[13] 趙國華, 陳宗道, 王光慈, 等. 改性對玉米蛋白質功能性質和結構的影響[J]. 中國糧油學報, 2000, 15(2): 28-31.

[14] YIN Shouwei, TANG Chuanhe, CAO Jinsong, et al. Effects of limited enzymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp(Cannabis sativaL.) protein isolate[J]. Food Chem, 2008, 106(3):1004-1013.

[15] 王文高, 陳正行, 姚惠源. 大米蛋白及其水解物功能性質與疏水性關系的研究[J]. 糧食與飼料工業, 2002(7): 49-50.

[16] 劉粼. 酶法有限水解對大豆分離蛋白乳化性能的影響[J]. 中國糧油學報, 2000, 15(1): 26-29.

Effect of Limited Alkaline Protease Hydrolysis on Functional Properties of Rapeseed Thermoresistant Protein

WANG Su-ya，LIU Sheng，JU Xing-rong，YAN Mei-rong，YUAN Jian
(School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

To improve functional properties, the thermoresistant protein extracted from rapeseed meal was limitedly hydrolyzed by alkaline protease hydrolysis. Also, the relationships between protein functions and degree of hydrolysis (DH)were investigated. The solubility, emulsifying capacity and oil absorption capacity of rapeseed thermoresistant protein all increased after alkaline protease hydrolysis. Its solubility increased with increasing DH, and the solubility of rapeseed thermoresistant protein with 10% DH was as high as 63.82% at pH 7, 2.1 times higher than before hydrolysis. The emulsifying capacity of the hydrolysate obtained at 2.0% DH was the best and the emulsifying index was 0.43 and 0.49 at pH 6.0 and pH 8.0, 0.13 and 0.11 higher than unhydrolyzed rapeseed thermoresistant protein, respectively. The hydrolysate obtained at 8%DH presented the highest oil absorption capacity, 4.39 g/g. Rapeseed thermoresistant protein was decomposed into peptides with a smaller molecular weight after the hydrolysis, so changes in some of its functional properties took place.

rapeseed thermoresistant protein；alkaline protease；degree of hydrolysis；functional properties

TS201.2

A

1002-6630(2010)13-0044-04

2009-10-20

國家“863”計劃項目(2007AA10Z331)

王素雅(1969—)，女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wsy_wangsy@sina.com