藏藥材蓮座薊質量標準研究

陳 燕， 易進海*， 德 吉， 劉倩伶

（1.四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041；2.西藏自治區藏醫院，西藏 拉薩 850000）

蓮座薊為菊科植物蓮座薊Cirsium esculentum(Sievers)C.A.Mey.的全草。為藏、蒙族習用藥材，具有散瘀消腫，排膿托毒，止血的功效，用于治療肺膿腫，瘡癰腫毒，皮膚病，肝熱，各種出血［1-2］。主要分布在我國西藏、新疆、內蒙古和東北等地，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥》第一冊和《內蒙古中草藥》。目前尚無質量標準研究，其化學成分也未見報道。本實驗對收集的4批蓮座薊藥材化學成分進行了系統預試，采用3種不同的展開劑和流動相對藥材進行了薄層鑒別及HPLC圖譜的定位核對，發現蓮座薊藥材中含有綠原酸、蘆丁等化合物，據文獻報道綠原酸、蘆丁具有抗炎、抗變態、抗病毒、解熱的作用［3-4］，與蓮座薊的功能主治相符。為此，參照《中國藥典》2005年版一部天山雪蓮項下的含量測定方法，采用HPLC法測定蓮座薊藥材中綠原酸、蘆丁的含量，為蓮座薊藥材的質量評價提供參考方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

顯微鏡:日本奧林巴斯生物顯微鏡、尼康(NIKON)攝影顯微鏡，顯微描繪儀:香港萊卡顯微描繪儀、北京第三光學儀器廠顯微描繪目鏡。顯微制圖:采用顯微描繪儀繪制，然后取其主要顯微特征，組合成顯微特征圖版，最后采用硫酸紙描繪而成。Waters高效液相色譜儀:包括Waters1525泵，2487雙通道紫外檢測器，Waters柱溫箱，Breeze液相色譜工作站。Brasson超聲清洗儀。塞多利斯十萬分之一電子天平。

1.2 試劑與樣品

綠原酸、蘆丁對照品(批號:110753- 200413；100080- 200306；中國藥品生物制品檢定所，含量測定用)。4批蓮座薊藥材由西藏自治區藏醫院提供，經四川省中醫藥科學院舒光明研究員鑒定為菊科植物蓮座薊Cirsiumesculentum(Sievers)C.A.Mey.的干燥全草。甲醇為美國Tedia色譜純，水為超純水，硅膠G(青島海洋化工廠)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

本品粉末綠褐色。用間苯三酚、濃鹽酸染色，置顯微鏡下觀察。結果可見，本品冠毛主軸由多細胞組成，直徑36～78 μm；冠毛非腺毛細長，單細胞，直徑22～39 μm，長至640 μm。苞片表皮細胞表面觀呈長條形，直徑10～27 μm，可見稀疏孔溝及斜紋孔。氣孔位于葉表面，呈橢圓形，直徑23～26 μm，不定細胞型。非腺毛由2～5個細胞組成，微彎曲，有的中部微溢縮狀，直徑11～18 μm。花粉粒淡黃棕色，類球形或闊橢圓形，直徑46～55 μm，外壁具鈍齒狀突起及細網狀雕紋，有的可見三萌發孔。導管網紋或螺紋，直徑10～65 μm。見圖1。

圖1 蓮座薊藥材顯微特征圖

2.2 薄層鑒別

取4批本品粗粉0.2 g，加甲醇2 mL，超聲處理20 min，靜置，上清液作為供試品溶液。另取蘆丁對照品、綠原酸對照品，各加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別條狀點于同一聚酰胺薄膜板上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖2。

圖2 蓮座薊藥材TLC圖譜

2.3 綠原酸、蘆丁的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Luna C18(2)(4.6 mm ×150 mm，5 μm)；柱溫:30 ℃；流動相:甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)；檢測波長為340 nm；流速:1.0 mL/min。理論板數按蘆丁峰計算應不低于8000。在此色譜條件下，綠原酸、蘆丁對照品、蓮座薊藥材的HPLC圖譜見圖3。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL，置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖3 蓮座薊藥材HPLC圖

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品5.34 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取綠原酸對照品8.51 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取蘆丁對照品溶液1.0 mL和綠原酸對照品溶液1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(每1 mL中含蘆丁0.02136 mg和綠原酸0.03404 mg)。

2.3.4 線性關系 精密吸取綠原酸、蘆丁對照品混合溶液 2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀中測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得綠原酸的回歸方程為:Y=2978884.5X－6843，r=0.9997。蘆丁的回歸方程為:Y=4925938X －33651.8，r=0.9998。結果表明綠原酸在0.06808 ～0.3404 μg、蘆丁在 0.04272 ～0.2136 μg范圍內呈良好線性關系。

2.3.5 精密度實驗 取2.3.3項下的對照品溶液5 μL，分別連續進樣5次，依法測定峰面積，結果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.83%、0.91%。表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性實驗 取2.3.2項下的供試品溶液(批號:01)，精密吸取 10 μL，分別于室溫放置 0、1、2、4、6、24 h后注入液相色譜儀，依法測定峰面積，結果綠原酸和蘆丁峰面積穩定，RSD分別為0.72%、0.88%，表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

2.3.7 重復性實驗 取樣品粉末(批號:01)5份，每份0.5 g，精密稱定，照2.3.2項下方法分別制成供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依法測定峰面積，測得綠原酸和蘆丁的含量分別為0.3452%和0.1536%，RSD分別為1.09%和1.14%。表明試驗方法良好。

2.3.8 加樣回收率實驗 取已知綠原酸和蘆丁含量的樣品(批號:01)粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，準確加入一定量的綠原酸對照品(0.3404 mg/mL)2.5 mL、蘆丁對照品(0.2136 mg/mL)2.0 mL，照含量測定項下操作，測定含量，計算回收率，綠原酸平均回收率為97.66%，RSD為1.06%；蘆丁平均回收率為97.73%，RSD為1.14%。結果見表1。

表1 綠原酸和蘆丁加樣回收率測定結果(n=6)

2.3.9 樣品含量測定 樣品4批，分別依2.3.2項下方法制成供試品溶液，依法測定，綠原酸和蘆丁含量測定結果見表2。

表2 蓮座薊藥材中綠原酸和蘆丁含量測定(n=3)

3 討論

提取方法的選擇 本試驗對供試品溶液的不同提取方法(超聲、回流)，不同提取溶劑(甲醇、50%乙醇)及不同提取時間(20、45 min)分別進行考察。結果50%乙醇25 mL超聲提取20 min綠原酸和蘆丁的含量均較高，雜質峰較少，該法簡便，可控性強。

蓮座薊的薄層色譜鑒別 曾參照2005年版一部天山雪蓮藥材的TLC展開條件乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 ∶6 ∶1 ∶2)的上層溶液為展開劑［5］，對樣品進行薄層色譜鑒別，發現色譜斑點間分離度較差，經反復試驗，采用聚酰胺薄膜板上，以醋酸為展開劑，展開效果較好，薄層色譜斑點清晰、明確。

曾比較研究流動相甲醇－0.4%磷酸(38∶62)和甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)，結果發現磷酸對峰形影響較大，拖尾嚴重，采用醋酸可改善此現象。

蓮座薊作為藏、蒙族地區常用藥材，其化學成分未見報道，本實驗通過對該藥材的顯微鑒別、TLC及綠原酸和蘆丁的含量測定的研究，初步建立了該藥材的質量標準，結果顯示該方法簡便、準確、重現性好，可作為蓮座薊藥材質量評價的參考方法。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會編.中華人民共和國衛生部藥品標準藏藥第一冊［S］.1995:84.

［2］內蒙古自治區衛生局編.內蒙古中草藥［M］.北京:內蒙古自治區人民出版社，1972:42.

［3］吳衛華，康 幀.綠原酸的藥理學研究進展［J］.天然產物研究與開發，2006，18:691-694.

［4］藏志和，曹麗萍.蘆丁藥理作用及制劑的研究進展［J］.醫藥導報，2007，26(7):760-768.

［5］中國藥典［S］.一部.2005:36.