高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定川芎提取液中7種有效成分

劉 潔，余李敏，翟 帆

（陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心，陜西 西安 710075）

川芎(Rhizoma Chuanxiong)為傘形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的干燥根莖，性溫、味辛，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，臨床主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)和頭痛等癥，是中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用的藥材之一［1］。川芎中含有酚酸、生物堿、內(nèi)酯和揮發(fā)油等多類有效成分，文獻(xiàn)常用的測定方法包括液相色譜-紫外檢測法、液相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳-紫外檢測法和氣相色譜-質(zhì)譜法等。上述方法為川芎的質(zhì)量控制作出了重要的貢獻(xiàn)，且具有良好的應(yīng)用前景。然而，如何建立一種川芎中多種有效成分同時測定的方法是值得探討的問題。本文采用液相色譜-質(zhì)譜同時測定川芎中7種有效成分的含量，旨在為川芎的綜合質(zhì)量控制做出貢獻(xiàn)。

1 儀器與材料

儀器:Agilent 1100系列高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(包括二元梯度泵，7725i手動進(jìn)樣器，DAD二極管陣列檢測器，SL型電噴霧-離子阱質(zhì)譜和Chmistation 5.2工作站)；Sartorius BP221s型電子分析天平(萬分之一，美國Sartorius公司)。

材料:香草醛為分析純；阿魏酸和鹽酸川芎嗪對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:110773-200612、110817-200305)；川芎內(nèi)酯 I、川芎內(nèi)酯 H、川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯對照品為本實驗室采用制備液相色譜制備，歸一化法測定純度均不低于96.0%；川芎藥材(四川產(chǎn))購于陜西省藥材公司，并由陜西省藥品檢驗所進(jìn)行鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為0.2%的乙酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫設(shè)置為:30%B保持5.0 min，30 min內(nèi)線性增加為80%B，保持5.0 min；柱溫為25.0℃；流速:0.8 mL/min(柱后3:1分流，V∶V)。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管電壓－3500 V，干燥氣流速7.0 L/min；干燥氣溫度325℃；霧化氣壓力45 psi；霧化氣溫度350℃；質(zhì)量掃描范圍50～1000 amu。

2.2 對照品供試品溶液的制備

精密稱取香草醛、阿魏酸、鹽酸川芎嗪、川芎內(nèi)酯I、川芎內(nèi)酯H、川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯對照品適量，加95%的甲醇配制成濃度分別為0.90，1.80，1.35，3.6，1.40，2.44 和2.10 mg/mL 的混合供試品溶液，4.0℃冷藏備用。

2.3 藥材供試品溶液的制備

取干燥川芎藥材，粉碎，過40目篩。精密稱取5.0 g藥材粉末，加入6倍量95%的甲醇水溶液，超聲30.0 min，過濾，重復(fù)3次，合并濾液，95%的甲醇水溶液定溶于100.0 mL量瓶中，4.0℃冷藏備用。

2.4 線性關(guān)系

取2.2項下對照品溶液適量，加95%甲醇水溶液配制成系列供試品溶液，在擬定分析條件下，精密吸取10.0 μL進(jìn)樣，采用離子阱質(zhì)譜的多級反應(yīng)模式(MRM)進(jìn)行分析，香草醛選擇m/z 153.1為母離子，m/z 126.1為子離子；阿魏酸選擇m/z 195.3為母離子，m/z 178.1為子離子；川芎嗪選擇 m/z 137.2為母離子，m/z 122.3為子離子，川芎內(nèi)酯 I選擇m/z 225.1為母離子，m/z 208.2為子離子，川芎內(nèi)酯H選擇m/z 225.1為母離子，m/z 208.2為子離子，川芎內(nèi)酯A選擇m/z 105.1為母離子，m/z 147.9為子離子，藁本內(nèi)酯選擇m/z 191.2為母離子，m/z 148.1為子離子，采集提取離子流圖，以各對照品提取離子峰峰面積對其濃度作圖，得線性回歸方程，計算線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系測定結(jié)果Tab.1 Results of calibration curve

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取2.3項下川芎供試品溶液20.0 μL，在擬定分析條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測定香草醛等有效成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種有效成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.12% ，0.94%，1.31%，1.20%，1.24%，0.97% 和0.82%(n=5)，表明該方法具有較好的精密度。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取川芎藥材粉末適量，按2.3項下的樣品制備方法平行制備藥材供試品溶液5份，在擬定分析條件下，進(jìn)樣分析，計算7種有效成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 0.96%，0.82%，1.231%，1.17%，0.94%，1.07%和0.91%(n=5)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取川芎藥材供試品溶液，分別于室溫放置0，4，8，12，24 h后依法測定7 種有效成分的含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.01%，0.87%，1.14%，1.05%，0.934%，1.07% 和0.76%(n=5)，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 分別取香草醛等7種有效成分含量分別為 0.06，0.21，0.04，0.97，0.32，8.20和12.53 mg/g的川芎藥材粉末約0.1 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入0.5、1.0和2.0 mL混合對照品溶液，按2.3項的樣品制備方法制備藥材供試品溶液。擬定分析條件下，測定各有效成分的含量，計算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種有效成分的平均回收率分別為98.7%，101.2%，99.2%，98.4%，102.5%，101.6%和99.7%(n=6)，對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為 1.2%、0.8%、0.5%、1.4%、0.6%、0.3%和0.7%，表明該方法回收率良好。

2.6 樣品含量測定

精密稱取川芎藥材粉末3份，每份0.5 g，按2.3項下樣品制備方法制備藥材供試品溶液。精密吸取20.0 μL，擬定分析條件下進(jìn)樣分析，總離子流圖見圖1。重復(fù)3次，測得藥材中7種有效成分含量的平均含量分別為:0.12，0.25，0.41，0.99，0.30，8.96和11.25 mg/g。

圖1 川芎藥材供試品溶液液相色譜-電噴霧質(zhì)譜總離子流圖1.香草醛 2.阿魏酸 3.川芎嗪 4.川芎內(nèi)酯I5.川芎內(nèi)酯H 6.川芎內(nèi)酯A 7.藁本內(nèi)酯Fig.1 Total ion current chromatogram of Ligusticum chuanxiong Hort.extraction1.Vanillin 2.Ferulaic acid 3.Ligustrazine 4.Senkyunolide I 5.Senkyunolide H 6.Senkyunolide A 7.Ligustilide

3 討論

3.1 文獻(xiàn)中有關(guān)川芎中有效成分含量測定的報道較多，常用的方法為高效液相紫外檢測法。然而，該方法每次僅能對川芎中的某一類有效成分進(jìn)行測定，且往往會因檢測波長的不同導(dǎo)致方法靈敏度下降，使其在川芎多成分分析方面的應(yīng)用受到限制。本文采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法測定了川芎中的7種有效成分，證明該法具有簡便、快速和定性定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，特別適合于藥材的多成分分析和指紋圖譜研究。

3.2 圖1中保留時間為23.4 min的色譜峰分離良好且強(qiáng)度較大，質(zhì)譜法測得其分子離子峰為m/z 357.4，與苯酞類化合物Coniferylferulate的質(zhì)譜信息一致，但由于缺少相應(yīng)的對照品，本文未能對該化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性和含量測定。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:28.

［2］韓 麗，黃媛莉，楊 明，等.川芎配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(12):2924-2925.

［3］曹建敏，王棕華，孫廣平，等.川芎中內(nèi)酯類化學(xué)成分的提取與溶劑萃取分離方法研究［J］.分析試驗室，2005，24(9):59-62.

［4］Jin Y U，Liang T U，F(xiàn)u Qing，et al.Fingerprint analysis of Ligusticum chuanxiong using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase liquid chromatography［J］.J Chromatography A，2009，1216:2136-2141.