蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌自由基代謝及ATP酶活性的影響

潘 燕，彭彥銘

(湖北師范學(xué)院體育學(xué)院，湖北黃石 435002)

蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌自由基代謝及ATP酶活性的影響

潘 燕1，彭彥銘2

(湖北師范學(xué)院體育學(xué)院，湖北黃石 435002)

探討蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌的保護(hù)作用，選用40只健康KM小鼠，按體重層次隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(A)、安靜給藥組(B)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(C)、運(yùn)動(dòng)給藥組(D)，每組10只，采用遞增負(fù)荷的游泳訓(xùn)練，共持續(xù)4周，最后一次訓(xùn)練至力竭，記錄小鼠游泳力竭時(shí)間，并測(cè)定心肌自由基含量、抗氧化酶及ATPase的活性。結(jié)果顯示給藥組小鼠游泳至力竭時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)，補(bǔ)充蜂膠黃酮的B、D組抗氧化酶及ATPase活性顯著高于其對(duì)照組(P＜0.05)，提示蜂膠黃酮可以提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力、延緩疲勞出現(xiàn)，對(duì)小鼠心肌組織具有保護(hù)作用。

蜂膠黃酮;疲勞小鼠心肌;自由基;ATP酶

自1978年Dillard首次提出自由基在運(yùn)動(dòng)性疲勞、損傷中的重要作用后，自由基在運(yùn)動(dòng)性疲勞、損傷中的意義己越來(lái)越受到人們的重視，很多學(xué)者均從不同角度間接揭示了運(yùn)動(dòng)與自由基的關(guān)系，并在應(yīng)用自由基清除劑抗運(yùn)動(dòng)性疲勞、損傷中取得一定效果。

蜂膠被譽(yù)為“紫色黃金”，是工蜂從植物的新生枝條、葉、芽或樹(shù)皮等組織上采集到樹(shù)脂狀分泌物后混入其上顎腺等腺體的分泌物和蜂蠟等加工而成的芳香性膠狀物，具有天然的抗氧化性能和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能的作用。蜂膠的生物學(xué)、藥理學(xué)及醫(yī)療功效主要與其所含的黃酮成分有關(guān)，其內(nèi)含40余種黃酮化合物，被譽(yù)為“黃酮化合物之寶庫(kù)”［1－4］。我們選用自由基的代謝產(chǎn)物MDA、抗氧化酶及ATP酶作為觀察指標(biāo)，觀察蜂膠黃酮的抗疲勞作用，旨在為蜂膠黃酮應(yīng)用到運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

健康雄性KM小鼠40只，5周齡，體重20g±2g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠7天，按體重分層隨機(jī)分4組，安靜對(duì)照組、安靜給藥組、運(yùn)動(dòng)力竭對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)力竭給藥組。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食水，具體分組及給藥方法見(jiàn)表1。

運(yùn)動(dòng)組小鼠采用無(wú)負(fù)重游泳方式進(jìn)行遞增訓(xùn)練，游泳時(shí)間為第一周30 min/d，第二周60 min/d，第三周90 min/d，第四周120 min/d，每周6 d，周日休息，如在游泳期間發(fā)現(xiàn)有力竭表現(xiàn)，撈出水面休息片刻，之后繼續(xù)游泳至規(guī)定時(shí)間，最后一次訓(xùn)練至力竭。力竭的標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠沉入水中超過(guò)10 s，且放在平面時(shí)無(wú)法完成翻正反射。

1.2.2 取材和處理

10%組織勻漿的制備:在小鼠最后一次游泳訓(xùn)練至力竭后，即刻處死小鼠，迅速取出其心臟，在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5 ml的小燒杯內(nèi)。用移液器量取0.86%冷生理鹽水，生理鹽水的體積總量應(yīng)是心肌組織的9倍，采用手工方式勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的10%勻漿用普通離心機(jī)3000 r/min離心10分鐘，留上清棄下面沉淀。

1.2.3 測(cè)試指標(biāo)的方法

MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定;SOD采用亞硝酸鹽抑制法測(cè)定;GSH－Px采用二硫代硝基苯甲酸(DTNB)直接顯色法測(cè)定;CAT采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定;ATP酶活性采用定磷法測(cè)定;蛋白定量采用考馬氏亮藍(lán)法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以X±SD表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蜂膠黃酮對(duì)小鼠力竭時(shí)間的影響

表2 小鼠游泳力竭時(shí)間的比較

C組小鼠的游泳力竭時(shí)間為178.36±43.31，而D組小鼠的游泳力竭時(shí)間為266.00±49.39，給藥組小鼠游泳力竭時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2 蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌自由基含量及抗氧化酶活性的影響

表3 各組小鼠心肌MDA、SOD、GSH－Px、CAT值的比較

2.3 蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌心肌ATP酶活性的影響

表4 各組小鼠心肌Na+－K+－ATP酶、Ca2+－Mg2+－ATP酶值的比較

3 分析與討論

3.1 蜂膠黃酮對(duì)小鼠機(jī)能狀態(tài)的影響

隨著運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組小鼠逐漸出現(xiàn)神態(tài)疲憊、食欲下降、毛發(fā)蓬亂枯燥、易受驚嚇、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等一系列疲勞征象，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中需休息的小鼠，休息的時(shí)間逐步增多，且運(yùn)動(dòng)后小鼠精疲力竭、喘息不止，體毛烘干時(shí)間較長(zhǎng);而給藥組小鼠眼光有神、反應(yīng)迅速、毛色光亮、掉毛現(xiàn)象不明顯，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中需休息的小鼠數(shù)量少、休息時(shí)間短、運(yùn)動(dòng)后無(wú)明顯的疲憊神態(tài)，且在訓(xùn)練出水后體毛烘干時(shí)間要少于對(duì)照組。提示服用蜂膠黃酮對(duì)小鼠機(jī)能狀態(tài)有很大程度的改善，促進(jìn)小鼠疲勞后的消除，提高了小鼠抗疲勞能力。

3.2 蜂膠黃酮對(duì)小鼠力竭時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)能力是多種因素綜合作用的結(jié)果，從供能方面看，耐力運(yùn)動(dòng)中主要的供能系統(tǒng)是有氧氧化系統(tǒng)。小鼠無(wú)負(fù)荷力竭游泳是一種有氧耐力運(yùn)動(dòng)，因此，小鼠力竭游泳時(shí)間的長(zhǎng)短將在一定程度上反映其有氧運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠黃酮組小鼠游泳至力竭的時(shí)間明顯長(zhǎng)于訓(xùn)練對(duì)照組，提示蜂膠黃酮具有提高機(jī)體耐力運(yùn)動(dòng)能力的作用。機(jī)理可能為蜂膠黃酮有強(qiáng)心作用，使心輸出量增加，提高血液中氧的運(yùn)輸，供給心肌充足的氧氣［6－7］，改善小鼠在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)心肌的相對(duì)缺氧狀況，以提高運(yùn)動(dòng)能力。

3.3 蜂膠黃酮黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌自由基代謝的影響

自由基是指具有未配對(duì)電子的原子、離子或分子等類物質(zhì)。由于自由基極不穩(wěn)定，很難在體內(nèi)直接測(cè)到，因而在實(shí)驗(yàn)中以脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量來(lái)反映細(xì)胞損傷程度。

自由基的活性很強(qiáng)，可廣泛攻擊含不飽和雙鍵的生物膜結(jié)構(gòu)，形成鏈鎖反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化后，脂質(zhì)自由基可從酶分子中奪取氫原子，形成膜蛋白自由基，通過(guò)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使酶分子發(fā)生聚合、交聯(lián)，進(jìn)而影響酶活性，導(dǎo)致其活性下降，使膜流動(dòng)性、變形性、完整性發(fā)生改變，加速組織老化和死亡，這可能是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性損傷的一個(gè)重要原因。自由基還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使過(guò)多細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。而心肌細(xì)胞屬終末分化細(xì)胞，是一種不具備增殖能力的成熟細(xì)胞。心肌細(xì)胞凋亡是心臟由代謝性變化向病理性變化發(fā)展的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，是運(yùn)動(dòng)性心肌微損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的病理機(jī)制之一［8－9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠在力竭運(yùn)動(dòng)后心肌MDA含量顯著上升，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異，心肌細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p害。蜂膠黃酮組小鼠不論是在安靜狀態(tài)下或力竭運(yùn)動(dòng)后，MDA含量顯著低于其相應(yīng)對(duì)照組，提示蜂膠黃酮可減少疲勞小鼠心肌自由基的含量，是一種高效的天然抗氧化劑。

3.4 蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)對(duì)抗氧自由基最重要的抗氧化酶，它的作用是將氧自由基歧化，將一分子氧自由基氧化成為O2，另一分子氧自由基還原為H2O2，因而，SOD活性的高低是機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的標(biāo)志;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－PX)是體內(nèi)廣泛存在的一種催化過(guò)氧化氫分解的重要酶，能特異地催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用;過(guò)氧化氫酶(CAT)可以催化兩個(gè)過(guò)氧化氫的氧化還原反應(yīng)，避免損傷生物膜結(jié)構(gòu)和影響生物膜功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌組織MDA的含量顯著升高，SOD、GSH－Px、CAT活性顯著降低，而蜂膠黃酮組小鼠SOD、GSH－Px、CAT活性均高于對(duì)照組，而MDA含量卻低于對(duì)照組。蜂膠黃酮提高了小鼠的抗氧化能力。其作用機(jī)理可能為蜂膠中的黃酮類化合物與超氧陰離子反應(yīng)阻止自由基反應(yīng)的引發(fā);或與鐵離子螯和阻止羥基自由基的生成;或與脂質(zhì)過(guò)氧化基反應(yīng)阻止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)［6］。

3.5 蜂膠黃酮對(duì)疲勞小鼠心肌ATP酶活性的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)引發(fā)心肌缺血缺氧，使心肌細(xì)胞能量代謝由有氧代謝轉(zhuǎn)為無(wú)氧代謝，細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯降低，與能量代謝密切相關(guān)的各種離子泵活動(dòng)減弱，導(dǎo)致離子代謝平衡失調(diào)，從而引發(fā)一系列功能紊亂。例如運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)Na+－K+－ATPase活性下降，無(wú)力維持靜息膜電位和細(xì)胞興奮性所必需的跨膜濃度差，其結(jié)果是肌細(xì)胞膜去極化的閾值增加，肌肉做功能力下降;同時(shí)由于肌細(xì)胞膜上ATP含量明顯減少，最終導(dǎo)致K+通道大量開(kāi)放，這種變化最終導(dǎo)致動(dòng)作電位降低，促使疲勞發(fā)生。正常心肌的收縮與舒張功能還有賴于心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)。運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)Ca2+－Mg2+－ATP酶活性下降，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，無(wú)論是細(xì)胞內(nèi)鈣升高還是減少，對(duì)細(xì)胞都有損傷作用。

本實(shí)驗(yàn)中蜂膠黃酮組小鼠心肌組織Na+－K+－ATP酶、Ca2+－Mg2+－ATP酶活均高于對(duì)照組，提示蜂膠黃酮對(duì)疲勞引發(fā)的小鼠心肌ATPase的下降有抑制作用。蜂膠黃酮對(duì)小鼠心肌ATPase的影響可能與其抗心肌缺血、抗氧化作用有關(guān):蜂膠黃酮通過(guò)提高SOD、CAT、GSH－PX活性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力、猝滅自由基、保護(hù)了細(xì)胞膜免受自由基損傷，也避免了由膜結(jié)構(gòu)損傷可能導(dǎo)致的Na+－K+－ATP酶、Ca2+－Mg2+－ATP酶活性的降低;也減少了線粒體巰基被氧化、磷脂酶A2被激活，減少了線粒體內(nèi)鈣離子的外流，有效地延緩活性氧對(duì)線粒體的損傷，從而保證ATP的有效生成，以提高運(yùn)動(dòng)能力。

4 結(jié)論

4.1 蜂膠黃酮可改善小鼠心肌相對(duì)缺氧、減少自由基生成而降低心肌脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，對(duì)心肌細(xì)胞起到了良好的保護(hù)作用。

4.2 蜂膠黃酮可加速疲勞后物質(zhì)、能量代謝的恢復(fù)及疲勞的消除，可提高機(jī)體耐力運(yùn)動(dòng)能力。

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Effect of propolis flavonoids on free radical metabolism and ATPase of cardiac muscle in fatigue rats

PAN Yan1，PENG Yan－ming2
(Physical Education College，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China)

This paper observed the protection of propolis flavonoids on the cardiac muscle in fatigue rats.40 KM rats were randomly divided into 4 groups:sedentary group(A)，sedentary and propolis flavonoids group(B)，exercise group(C)，exercise and propolis flavonoids group(D).Each group of 10，C and D group had trained 4 weeks by increasing exercises loads gradually and after the last time they swam exhaustively.the activity of anti－ oxide enzyme，ATPase and the content of MDA in cardiac muscle were estimated，the time of exhaustive exercise was contrasted.The result showed that the time of D was longer significantly than C(P ＜0.05)，the activity of anti－oxide enzyme of B and D increased significantly than A and C(P ＜0.05).The above data suggested that the propolis flavonoids can improve the rats’exercise performance and delay the sports fatigue，protect cardiac muscle tissue against free radical damage.

propolis flavonoids;cardiac muscle in fatigue rats;free radical;ATPase

G804.7

A< class="emphasis_bold"> 文章編號(hào):1

1009－9840(2010)04－0030－03

2010－10－18

湖北省教育廳科技處重點(diǎn)項(xiàng)目(D20092201)，湖北師范學(xué)院研究生啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2008D57)

潘燕(1979－ )，女，內(nèi)蒙古人，碩士，講師，主要從事運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)的教學(xué)與研究。