海金沙黃酮體外抗氧化活性研究

王桃云,陳 娟,彭志任,吳 瓊,陳 鵬

(1.蘇州科技學院,江蘇蘇州 215009;2.萍鄉市林科所,江西萍鄉 337000; 3.湘東區林業局,江西萍鄉 337016;4.揚州大學,江蘇揚州 225001)

海金沙黃酮體外抗氧化活性研究

王桃云1,陳 娟2,彭志任3,吳 瓊1,陳 鵬4,＊

(1.蘇州科技學院,江蘇蘇州 215009;2.萍鄉市林科所,江西萍鄉 337000; 3.湘東區林業局,江西萍鄉 337016;4.揚州大學,江蘇揚州 225001)

目的：研究海金沙黃酮(Flavones fromLygodium japonicum,FLJ)的制備與體外抗氧化活性。方法：通過回流法萃取和大孔吸附樹脂純化,得到純化的 FLJ。以VC、BHT、蘆丁和槲皮素為陽性對照,對羥基自由基、超氧陰離子自由基、烷基自由基的清除率以及抑制油脂過氧化的能力進行研究。結果：FLJ對上述自由基均有一定的清除作用,對羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力弱于VC、蘆丁和槲皮素;對油脂抗氧化作用強于 BHT和 VC。濃度為 1.04mg/mL的 FLJ和VC對烷基自由基的清除能力相當。FLJ的添加量在實驗范圍內與其抗氧化活性呈正相關。結論：FLJ具有明顯的體外抗氧化活性。

海金沙,黃酮,抗氧化活性,清除自由基,體外

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蘆丁、槲皮素、亞油酸 Sigma公司,色譜純;三氯化鋁、鄰苯三酚、甲醇、乙醇、水楊酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氯仿、乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、VC、BHT、FeSO4等 均為國產分析純;豬油 市售,肥豬板油煎制;海金沙 10月中旬采自蘇州市上方山森林公園。

UV-2450紫外-可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;RE52-A旋轉蒸發儀 上海亞榮玻璃儀器廠;101-1-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫學器械廠;FA2004N型電子天平 上海恒平科學儀器有限公司;GL-12B型臺式離心機 上海飛鴿離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 FLJ樣品液的制備 將海金沙洗凈,烘干,粉碎后過 100目篩,粉末于烘箱中干燥至恒重,稱取10.00g海金沙干粉,加入 200mL 75%乙醇,85℃下恒溫回流提取 4h,提取液在 5000r/min下離心 20min,得上清液,重復提取兩次,將兩次離心上清液合并,旋轉蒸發濃縮至原體積的 1/4;加入等體積的石油醚,在分液漏斗中分層,棄上相,取下相。將下相液倒入燒杯中,用保鮮膜封口,于 4℃下靜置 24h后,在5000r/min下離心 20min,得上清液,將上清液濃縮至原體積的 1/5,待用。

1.2.2 樣液中 FLJ的純化 選用AB-8型大孔吸附樹脂對所得 FLJ溶液進行純化,稱取適量樹脂,預處理后。以 70%乙醇裝層析柱、平衡,用去離子水洗脫后,調 pH至 6.0。緩慢上樣,用 3～4倍體積的去離子水洗去多糖、蛋白質等雜質。依次用 50%、60%、70%、80%、95%乙醇進行梯度洗脫,每次更換乙醇濃度前應檢驗終點。收集所有含 FLJ的洗脫液,旋轉蒸發至所需的濃度。

1.2.3 標準曲線的繪制 精密吸取在 120℃干燥至恒重的蘆丁對照品 0.2193g,置于 100mL的容量瓶中,加 10%的甲醇 70mL,置于水浴上微熱至溶解,放冷,加 10%的甲醇稀釋至刻度,搖勻。精確吸取10.0mL,置于 100mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液。

精密吸取已制備的對照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置于 25mL容量瓶中,各加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亞硝酸鈉 0.7mL,混勻,靜置 5min,加 10%硝酸鋁 0.7mL,混勻,靜置 6min,加 1mol/L NaOH 5mL,再加30%乙醇至刻度,混勻,靜置 10min,用紫外分光光度計在 510nm處測定吸光度,繪制濃度 Y與吸光度X的標準曲線。

1.2.4 FLJ最佳吸收波長的確定 精密量取已制備的對照品溶液 1.0mL,置于 25mL容量瓶中,加 30%乙醇至 12.5mL,加 5%亞硝酸鈉 0.7mL,混勻,靜置5min,加 10%硝酸鋁 0.7mL,混勻,靜置 6min,加1mol/L NaOH 5mL,再加 30%乙醇至刻度,搖勻,靜置 10min,用紫外分光光度計在 200～800nm范圍內進行掃描,得掃描圖。

1.2.5 FLJ對羥基自由基(·OH)清除率的測定[1]利用 H2O2對 Fe2+混合產生·OH,在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質,該物質在 510nm下有最大吸收。各試管中分別加入不同濃度的 FLJ溶液 2mL,9mmol/L水楊酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,最后加入 8.8mmol/L H2O2啟動反應,37℃反應0.5h,以蒸餾水為空白對照,在 510nm下測量各待測液的吸光度?？紤]到本身的吸光值,以 9mmol/L水楊酸-乙醇 2mL,9mmol/L FeSO42mL,不同濃度的FLJ溶液 2mL為黃酮的本底吸收。清除率的計算公式為：

式中：A0為空白對照液的吸光度;Ax為加入黃酮溶液后的吸光度;Ax0為不加黃酮溶液本底的吸光度。

式中：A0為空白對照液的吸光度;A1為加入黃酮溶液后的吸光度。

1.2.7 FLJ對烷基自由基清除率的測定[3-4]取2.5mL 95%乙醇、2.5mL 0.1mol/L pH8磷酸緩沖液、0.05mL亞油酸和 0.5mL FLJ樣品液,充分混合,用10W紫外燈照射 60min,然后加入 2mL三氯乙酸(20%)和 0.5mL硫代巴比妥酸 (3%,W/V),95℃水浴反應 90min,冰浴冷卻,5000r/min離心 20min,于532nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以等體積雙脫氧水代替 FLJ樣品液,以同濃度的蘆丁和 VC作為對照。烷基自由基清除率的計算公式為：

式中：A0為空白組吸光度;Ai為加樣品液組的吸光度。

1.2.8 FLJ抑制油脂氧化效果測定[5-6]稱取已測定POV的豬油 4份,每份 40.0g置于 250mL的錐形瓶中,第 1份加入 6mL乙醇作為空白對照,第 2份加入6mL 0.5mg/mL VC,第 3份加入 6mL 0.5mg/mL BHT,第 4份加入6mL 0.5mg/mL FLJ,充分振搖后,置 65℃恒溫干燥箱中,每隔 24h取 2.0g油樣測定 POV值。每次取樣后充分振搖錐形瓶,以混入足夠的空氣。油脂過氧化值 (POV)測定方法：按照 GB/T5538-1995的方法測定。

稱取試樣 2.0g,加入到 250mL錐形瓶中。在裝有試樣的錐形瓶中加入 10mL氯仿溶解試樣,加入15mL乙酸和 1mL碘化鉀飽和溶液,迅速蓋好瓶塞,混勻溶液1min,在 25℃避光靜置 5min。加入約75mL蒸餾水,以 0.5%淀粉溶液為指示劑,用硫代硫酸鈉標準溶液滴定析出的碘,滴定過程要用力振搖。過氧化值計算公式為：

式中：V1是用于測定的硫代硫酸鈉標準溶液的體積,mL;V2是用于測定豬油的硫代硫酸鈉標準溶液的體積,mL;C是硫代硫酸鈉標定濃度,mol/L;M是試樣的質量,g。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的制作

按 1.2.3所述方法,得標準曲線如圖 1所示。

圖1 蘆丁標準曲線

由圖 2可得回歸方程為：Y=10.148x+0.0069, R2=0.9998,該標準曲線在 0.022～0.11mg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.2 FLJ最佳吸收波長的確定

由 1.2.4所述方法對 FLJ進行測定,所得光譜掃描結果如圖 2所示。

圖2 海金沙黃酮吸收光譜圖

由圖 2可知,在 200～600nm波長范圍內,FLJ的吸收峰對應波長為 355nm,此波長即為 FLJ的最佳吸收波長。

2.3 FLJ對·OH的清除率

按1.2.5所述方法,得不同濃度下 FLJ、VC和槲皮素對·OH的清除率,如圖 3所示。

圖3 FLJ、VC、槲皮素對·OH的清除率

從圖 3可知,隨著三種物質在反應液中濃度的增加,對·OH的清除率呈上升趨勢,當 VC濃度為0.11mg/mL時,其·OH清除率趨近于 100%,此時FLJ和槲皮素的·OH清除率分別是 10%和 22%,因此,FLJ對·OH具有一定的清除力,但作用效果比VC和槲皮素差。

按1.2.6所述方法,得不同濃度下 FLJ、VC和蘆丁對的清除率,如圖 4所示。

圖 4 FLJ、蘆丁、VC對·的清除率

由圖 4可知,FLJ、VC和蘆丁對·均有不同程度的清除作用,而且這三種抗氧化劑對·的清除作用與其濃度呈量效關系,清除率隨著其濃度的提高而增大。當抗氧化劑濃度為 1.04mg/mL時,FLJ、蘆丁和VC對·的清除率分別為：59.5%、82.6%和98.8%,蘆丁和VC的清除作用都強于 FLJ。同時,隨著濃度的增大,FLJ對·清除作用的增長趨勢比蘆丁和 VC強。因此,FLJ對·具有較好的清除作用。

2.5 FLJ對烷基自由基的清除率

按 1.2.7所述方法,分別對不同質量濃度的 FLJ、VC和蘆丁對亞油酸氧化體系的抑制能力進行實驗,結果如圖 5所示。

圖 5 FLJ、蘆丁、VC對烷基自由基的清除率

從圖 5可知,FLJ、蘆丁和VC對烷基自由基引發的亞油酸氧化體系均有不同程度的抑制作用,在實驗濃度范圍內,三種抗氧化劑在實驗濃度范圍內對烷基自由基的清除率隨各自濃度的提高而增大,且在不同濃度范圍內,清除率有顯著差異。當三種抗氧化劑的濃度達到 1.04mg/mL時,FLJ、蘆丁和VC對烷基自由基的清除率分別達到 57.01%、67.72%和58.84%,FLJ與蘆丁和VC對烷基自由基的清除效果相當。因此,FLJ對烷基自由基具有較好的清除作用。

2.6 FLJ抑制油脂氧化效果

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基,自由基與空氣中的氧反應生成自由基和過氧化物,可以用油脂的 POV值來評價其氧化程度,POV值越小,則油脂被氧化的程度越小。按 1.2.8所述方法,得不同濃度下VC、BHT和 FLJ抑制油脂氧化效果,結果如圖6所示。

由圖 6可知,空白樣在沒加抗氧化劑時,油脂的POV隨著時間的延長不斷升高。加入抗氧化劑 FLJ、VC和BHT后,油脂的 POV在 7d后隨時間的延長而增加程度明顯比空白要低,且經 FLJ處理的油脂的POV值明顯比BHT和VC處理的油脂 POV值低。因此,FLJ對抑制油脂氧化具有良好的效果。

圖6 FLJ、VC、BHT對油脂氧化的抑制作用

3 結論

體外抗氧化實驗結果表明,FLJ有一定的的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基作用;具有較強的清除烷基自由基以及抑制油脂過氧化的能力;FLJ作為抗氧化功能因子在保健功能食品中的應用前景廣闊。

[1]高蔭榆,洪雪娥,羅麗萍,等 .甘薯葉柄藤類黃酮的體外抗氧化作用研究[J].食品科學,2006,27(7)：103-106.

[2]嚴建剛,張名位,楊公明,等 .芹菜黃酮的提取條件及抗氧化活性研究[J].西北農業科技大學學報：自然科學版,2005, 33(1)：32-36.

[3]張勇,王純鋼,馮沖,等 .紅三葉黃酮抗氧化性研究[J].食品科技,2006(4)：78-81.

[4]王紹美 .茶多酚與VC對豬油乳化體系協同抗氧化性研究[J].食品工業科技,2000,21(6)：24-27.

[5]許宗運 .七種植物提取物對豬油的抗氧化性研究[J].塔里木農墾大學學報,2003,15(4)：1-5.

[6]趙聲蘭 .核桃油自氧化及其抗氧化的實驗研究[J].食品工業科技,2001,22(2)：27-29.

Study on antioxidant activity of flavones from Lygodium japonicum in vitro

WANG Tao-yun1,CHEN Juan2,PENG Zhi-ren3,W U Qiong1,CHEN Peng4,＊
(1.Suzhou Science and TechnologyUniversity,Suzhou 215009,China; 2.The Forestry Research Institute of Pingxiang,Pingxiang 337000,China; 3.ForestryBureau of Xiangdong County,Pingxiang 337016,China; 4.Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)

O b jec tive：To s tudy the antioxidant ac tivities of FLJ in vitro.M e thods：The FLJ was extrac ted by m e thod of reflux extrac tion and p urified by m ac rop orous adsorp tion res in.The scaveng ing cap ac ities on hyd roxyl free rad ica l, sup e roxide anion rad ica l and a lkyl rad ica l as we ll as inhib ition of POV va lue of the FLJ we re de tec ted while the VC, BHT,que rce tin and rutin flavonoids we re used as p os itive control.Results：The FLJ had som e scaveng ing ab ility on a ll rad ica l had been s tud ied in this exp e r im ent.The scaveng ing ac tivity on hyd roxyl free rad ica l,sup e roxide anion rad ica lwas weake r than VC,que rce tin and rutin flavonoids.W hen the concentra tion was1.04m g/mL the FLJ and VChad equiva lent effec ts on the a lkyl rad ica l.But the FLJ had s tronge r antioxidant ac tivities on inhib ition of POV va lue than BHT and VC.The am ount of FLJ used was in d irec t p rop ortion to the antioxida tion.Conc lus ion：The FLJ had rem a rkab le in vitro antioxidant ac tivity.

Lygod ium jap onicum;flavones;antioxidant ac tivity;scaveng ing cap ac ity to rad ica l;in vitro

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0193-04

海金沙 (Lygodium japonicum)系海金沙科(Lygodiaceae)多年生蕨類植物,海金沙草是海金沙植物的地上部分。資料報道,海金沙中含有黃酮類化合物,而黃酮類化合物是人體所必需的營養素之一,但人體自身不能合成,只能從食物中攝取,黃酮類化合物具有抗氧化、清除體內自由基、抗衰老抗心律失常、降血糖、降血脂等功效。近年來,研究自由基及其抑制劑、清除劑和動力學機制逐漸成為生物及醫學研究中的一個新方向,越來越受到人們關注,并取得了一定的研究成果。本實驗利用回流法萃取的海金沙黃酮,對其體外抗氧化活性進行研究,旨在為海金沙綜合開發利用提供理論依據。

2009-06-01 ＊通訊聯系人

王桃云 (1973-),男,講師,在讀博士研究生,研究方向：生物化學技術與天然產物研究與開發。