基于螯合機理的桑葉提取物抗氧化活性研究

鄒碧群,張 業,王 凱,楊新平,義祥輝,＊

(1.桂林師范高等專科學校化學與工程技術系,廣西桂林 541001; 2.廣西師范大學化學化工學院,廣西桂林 541004; 3.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541004)

基于螯合機理的桑葉提取物抗氧化活性研究

鄒碧群1,2,張 業1,王 凱2,楊新平3,義祥輝1,2,＊

(1.桂林師范高等專科學校化學與工程技術系,廣西桂林 541001; 2.廣西師范大學化學化工學院,廣西桂林 541004; 3.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541004)

用超聲波提取法以及大孔樹脂對桑葉進行初步提取,得到三個提取物 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。在對三個提取物進行DPPH自由基清除能力研究的基礎上,利用紫外吸收光譜法研究了桑葉提取物與 Fe2+、Fe3+的螯合作用。結果表明,三個桑葉提取物皆對DPPH自由基具有良好的清除效果,提取物Ⅰ、Ⅱ對 Fe2+、Fe3+具有良好的螯合作用,提取物Ⅲ僅對 Fe3+表現出良好的螯合作用。

桑葉,抗氧化,螯合

因此,研究與開發既具有清除自由基能力,又能夠通過螯合過渡金屬陽離子來阻止人體 Fenton反應發生的抗氧化劑,已經成為了抗氧化劑新的研究熱點之一[4-5]。桑葉始載于《神農本草經》,為桑科落葉喬木桑樹 (M orus alba L.)的葉,味苦、性寒,有散風祛熱、清肝明目等功效,且含黃酮類化合物,約占 1%～3%[6-7]。而黃酮類化合物正是一類天然抗氧化劑,可以減少和清除自由基,具有延緩人體衰老、防治疾病的作用[8],更重要的是部分黃酮類化合物還具有與金屬離子螯合的能力,抑制人體 Fenton反應[4]。基于上述背景,本文在利用DPPH法對桑葉三個提取物自由基清除能力進行研究的基礎上,對其與鐵離子以及亞鐵離子的螯合性能進行了研究,旨在為進一步研究桑葉的抗氧化活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 采自桂林師范高等專科學校生物園,自然干燥,粉碎過篩;大孔吸附樹脂 天津市津科細化工研究所生產;其他試劑 均為分析純。

JBT/FCT型釜罐式超聲波提取設備,KQ5200-B型超聲波清洗機,RE501型旋轉蒸發儀,SHB-Ⅲ循環水式真空泵,TU-1901雙光束紫外可見分光度計, DJ靈巧型粉碎機。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葉不同提取物的制備 稱 50.0g粉碎的桑葉于 600mL蒸餾水中,85℃恒溫,置于超聲波提取設備中提取 1h,重復三次,抽濾。減壓濃縮濾液得5.21g膏狀提取物 Ⅰ,收率 10.42%。把浸膏 Ⅰ以1mL/min的速度過大孔樹脂柱,水洗至無色,濃縮得1.35g提取物Ⅱ,收率 2.7%。繼續用 80%乙醇洗脫大孔樹脂吸附物至完全,濃縮得 2.48g棕黑色微晶提取物Ⅲ,收率 4.97%。

1.2.2 抗氧化活性的測定 采用DPPH法,桑葉提取物對 DPPH自由基的清除作用的測定見參考文獻[9]。將各提取物浸膏配制成系列溶液,測定待測桑葉提取液對DPPH自由基清除率,并繪制DPPH自由基清除率對桑葉提取液濃度曲線式 (1),并以此計算 I C50值。

式中：A0與At分別代表自由基在 517nm時空白與樣品對其作用后的吸光度。

1.2.3 螯合作用的測定 室溫下,將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別配成 1mg/mL的水溶液,進行紫外光譜掃描。然后,把鐵離子、亞鐵離子分別配制成不同濃度的溶液。分別移取各離子不同濃度的溶液 0.1mL,加入到3.9mL提取物水溶液中,混合振蕩,30min后掃描紫外光譜,由紫外光譜的變化探討桑葉提取物與鐵離子、亞鐵離子的螯合情況。

2 結果與討論

2.1 桑葉提取物對DPPH自由基的清除作用

I C50常用來比較清除 DPPH自由基的能力大小, I C50值越低,表明其清除自由基的能力越強,抗氧化能力越強。結果表明,桑葉提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 I C50分別為 2.78、0.38、0.48mg/mL,這說明了桑葉提取物對DPPH自由基有良好的清除作用。

2.2 桑葉提取物的紫外吸收光譜

由圖 1可以看出,提取物Ⅰ有λ1=216.0nm,λ2= 271.0nm這兩個紫外吸收峰,最大吸收波長、最大吸收值和質量吸收系數分別為λmax=216.0nm,Amax= 7.6,ε=76L·g-1·cm-1;提取物Ⅱ有一個吸收峰,吸收波長、吸收值和質量吸收系數分別為 λmax= 206.0nm,Amax=4.3,ε=43L·g-1·cm-1;提取物Ⅲ有三個吸收峰,分別為λ1=214.0nm,λ2=272.0nm,λ3= 319.0nm,其中最大吸收波長、最大吸收值和質量吸收系數分別為λmax=214.0nm,Amax=5.7,ε=57L·g-1·cm-1。每個提取物的最大吸收峰的位置與黃酮類化合物的吸收值基本一致,說明了桑葉提取物的主要成分是黃酮類化合物[10]。

圖1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的紫外吸收譜

2.3 桑葉提取物與 Fe2+、Fe3+的螯合作用

抗氧化劑與 Fe2+、Fe3+的螯合作用很復雜,目前一般可以通過紫外光譜法和熒光光譜法等來進行表征[4]。本文中,我們采用紫外光譜法。提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對不同濃度 Fe2+和 Fe3+螯合結果見圖 2～圖 4。由圖 2可見,提取物Ⅰ隨著 Fe2+濃度的增加,最大吸收峰發生紅移,吸收度也逐漸增加;同時,隨著 Fe3+濃度的增加,其最大吸收波長發生大范圍紅移。

圖 2 提取物Ⅰ對 Fe2+、Fe3+的螯合光譜

由圖 3可見,提取物Ⅱ的吸收峰隨著 Fe2+、Fe3+濃度的增加而發生紅移現象,吸收度也相應地增大,并且產生新的吸收峰。

圖 3 提取物Ⅱ對 Fe2+、Fe3+的螯合光譜

由實驗發現,提取物Ⅲ僅與 Fe3+發生螯合作用(圖 4),其吸收峰隨著 Fe3+濃度的增加而發生相應的紅移,且吸收度逐漸增大。

圖 4 提取物Ⅲ對 Fe3+的螯合光譜

總之,隨著 Fe2+、Fe3+濃度的增加,提取物的紫外特征吸收峰發生了紅移現象,吸收度逐漸增大,說明桑葉提取物與 Fe2+、Fe3+發生了螯合,生成了新的物質。由此可見,桑葉提取物是良好的螯合劑,可螯合Fe2+或 Fe3+,防止其參與 Fenton反應,能夠間接降低了羥自由基和氧自由基的產生。

3 結論

實驗結果表明,桑葉提取物對 DPPH自由基有良好的清除作用,是一種良好的自由基清除劑;同時,桑葉提取物Ⅰ、Ⅱ對 Fe2+或 Fe3+具有很好的螯合作用,能間接降低了羥基自由基和氧自由基的產生,是良好的螯合劑,以上研究對桑葉進行基于抗氧化活性的進一步篩選具有重要的指導意義。

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Study on antioxidant activity of extracts of M orus alba L.leaves based on chelation mechanism

ZOU Bi-qun1,2,ZHANG Ye1,WANG Ka i2,YANG Xin-ping3,Y I X iang-hui1,2,＊
(1.Depar tment of Chemistry and Engineering Technology,Guilin Normal College,Guilin 541001,China; 2.School of Chemistry and Chemical Engineering,GuangxiNormalUniversity,Guilin 541004,China; 3.College of Phar macy,GuilinMedical College,Guilin 541004,China)

Leaves of M orusa lba L.was extrac ted w ith ultrasonic wave,then was dea led w ith m ac rop orous adsorp tion res in to ge t three extrac tⅠ,Ⅱ andⅢ.Based on the s tudy of scaveng ing ac tivities ofⅠ,Ⅱ andⅢaga ins tDPPH free rad ica l,UV-vis sp ec troscop y was emp loyed to s tudy the ir che la tion ab ilities w ith fe rrous and iron ion.The results showed tha t a ll extrac ts exhib ited good scaveng ing ac tivities on DPPH free rad ica l.Extrac tⅠandⅡshowed favorab le che la tion ab ilities w ith both of fe rrous and iron ion,while extrac tⅢ dem ons tra ted only good che la tion ab ility w ith iron ion.

M orus a lba L.;antioxidant;che la tion

TS201.2

A

1002-0306(2010)02-0065-03

自由基 (free radical)通常指獨立存在的帶有未成對電子的原子或原子基團、分子或離子,如 O-2·、HO·、Ar O·等。人體生命活動進程中,自由基發揮著重要的作用。正常情況下,人體內自由基的產生和清除是平衡的,一旦自由基產生過多或抗氧化體系出現故障,體內自由基代謝就會出現失衡,可引起蛋白質、核酸 (DNA)變性,導致細胞和組織器官損傷,誘發各種疾病,加速機體衰老[1]。過渡金屬陽離子是自由基生成強有力的催化劑,它們可參與人體中的 Fenton反應[2],將超氧化物轉變為極其活躍的羥自由基和氧自由基[3]：

2009-03-18 ＊通訊聯系人

鄒碧群 (1982-),女,碩士生,從事藥物合成和天然產物的研究與開發工作。

國家自然科學基金(20762001);廣西科技開發計劃(桂科能05112001-3B2);廣西區教育廳科研項目 (200507067、200807MS076、200807MS075)。