擠壓預處理后小麥面筋蛋白酶解特性的變化

趙海鋒,柴 華,趙謀明,＊,崔 春,王金水

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州 450052)

擠壓預處理后小麥面筋蛋白酶解特性的變化

趙海鋒1,柴 華1,趙謀明1,＊,崔 春1,王金水2

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州 450052)

小麥面筋蛋白經擠壓預處理后,利用復合蛋白酶(Protamex)和木瓜蛋白酶(Papain)酶解。與未擠壓的酶解產物相比較,經擠壓預處理后的酶解產物水解度明顯提高(77%～122%),鮮味明顯增強,但蛋白質回收率有所下降。擠壓預處理后的小麥面筋蛋白酶解產物高分子組分減少,低分子組分顯著增加,面筋蛋白酶解液中的鮮味物質以小分子肽和游離氨基酸為主。

擠壓預處理,小麥面筋蛋白,酶解特性,風味

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白 河南蓮花味精集團;復合蛋白酶(Protemax) 丹麥諾維信公司;木瓜蛋白酶(Papain) 廣州裕立寶國際有限公司;標準肽樣品GlobinⅢ(分子量 2512)、GlobinⅡ(分子量 6214)、GlobinⅠ(分子量 8519)、GlobinⅠ +Ⅲ(分子量10700)、GlobinⅠ+Ⅱ(分子量 14404)、Globin(分子量 16949),美國 Amersham公司;NaOH、HCl、甲醛 國產分析純。

LC26A型高效液相色譜儀 日本島津公司; KDN-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司; HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽 上海福馬實驗設備有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市宏華儀器有限公司;SPJ-40雙螺桿擠壓機 陜西得愛食品公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質含量的測定 采用微量凱氏定氮法,小麥面筋蛋白的換算系數為 5.7[8]。

1.2.2 氨基氮的測定 酶解液中氨基氮測定采用甲醛滴定法[9-10]。

1.2.3 水解度測定[11]計算公式如下：

水解度 (DH,%)= [(N2-N1)/(N0-N1)] ×100%

式中：DH-水解度,%;N0-總氮含量,%;N1-酶解前游離氨基酸含量,%;N2-酶解后游離氨基酸含量,%。

1.2.4 蛋白質回收率的測定[12]酶解液經 4000r/min離心分離 20min,取上清液按半微量凱氏定氮法測定水溶性蛋白質含量。

蛋白質回收率(PR,%)=(水溶性蛋白含量/原料蛋白含量)×100%

1.2.5 酶解液的分子量分布 采用 Amersham蛋白質分析純化系統,分離柱為 Superdex-peptide 30/100 GL預裝柱 (Vt=24.0mL,Vo=8.0mL),進樣體積為40μL,檢測波長為 214nm,最大壓力為 1.8MPa,洗脫液為含 0.25mol/L NaCl的 pH7.2磷酸緩沖液,洗脫流速為 0.5mL/min。

標準肽樣品與洗脫體積擬合直線方程為：

y=-0.0578x+4.6289(R2=0.9960)

其中：y-標準肽分子量的對數;x-是洗脫體積,mL。

1.2.6 氨基酸 (AA)組成分析 樣品酸解后用高效液相色譜 (HPLC)分析,色氨酸則將樣品堿解后用HPLC分析。

氨基酸檢測條件：美國Waters高效液相色譜, PI CO.T AG氨基酸分析柱,溫度為 38℃,流速為1mL/min,檢測波長為 254nm。

1.2.7 感官評定[13]取小麥面筋蛋白酶解液的上清液加入 0.5%NaCl,混合均勻后,置于 60℃水浴中加熱,然后進行感官評定。以表 1為標準對各個酶解液進行鮮味評分。

表1 鮮味強度分析的標準溶液

1.3 工藝方法[14]

1.3.1 小麥面筋蛋白擠壓膨化處理 采用干法擠壓,在前期研究的基礎上設定擠壓機機筒溫度為150℃,螺桿轉速為 135r/min,模孔孔徑 5mm,物料濕度 20%,以 4±0.5kg/min的喂入量通過擠壓機,當擠壓機運轉穩定并達到設定的溫度后開始收集樣品,樣品放入烘箱中烘干到含水率為 5%,碾磨過 40目篩。

1.3.2 酶解條件及工藝 用于小麥面筋蛋白酶解的酶種類、酶解條件及工藝如下：

Protamex酶解條件：pH6.8,溫度 50℃,酶濃度3500U/g,蛋白濃度 8%,酶解時間 3.0h;Papain酶解條件：pH6.5,溫度 50℃,酶濃度 4000U/g,蛋白濃度6%,酶解時間 4.5h。

小麥面筋蛋白→加水攪拌→懸浮液→調節 pH→水浴中加熱攪拌→達到最適作用溫度后加入蛋白酶→攪拌酶解→沸水浴中加熱滅酶 (100℃,15min)→冷卻→10000r/min離心15min→測上清液的酶解指標

2 結果與討論

2.1 擠壓預處理后小麥面筋蛋白酶解產物水解度的變化

分別采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解擠壓預處理前后的小麥面筋蛋白,測定其酶解產物水解度,以考察擠壓預處理前后水解度的變化,結果見圖 1。

圖 1 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物的水解度

由圖 1可以看出,擠壓預處理可以顯著提高小麥面筋蛋白酶解產物的水解度。擠壓預處理前后, Protamex和 Papain酶解產物的水解度分別從 6.93%提到 15.39%和從 6.17%提高至 10.94%,分別提高了122%和 77%。這可能是因為擠壓預處理使得小麥面筋蛋白變性,結構變得更為疏松,有利于酶的作用,從而提高了酶解產物的水解度[15]。

2.2 擠壓預處理后小麥面筋蛋白酶解產物蛋白質回收率的變化

分別采用 Protamex和 Papain蛋白酶水解擠壓預處理前后的小麥面筋蛋白,測定其酶解產物的蛋白質回收率,以考察擠壓預處理前后蛋白質回收率的變化,結果見圖 2。

表 2 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物中肽分子量分布

圖2 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物的蛋白質回收率

由圖 2可知,擠壓預處理降低了小麥面筋蛋白酶解產物的蛋白質回收率。擠壓預處理前后, Protamex和 Papain酶解產物的蛋白質回收率分別降低了7.5%和12.2%。這可能是由于小麥面筋蛋白分子及分子間內二硫鍵的形成、酶解產物相互作用、重新聚集的緣故[16]。綜合水解度和蛋白質回收率的結果,Protamex酶解的效果優于 Papain酶解效果。

2.3 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物肽分子量分布的變化

擠壓預處理前后小麥面筋蛋白 Protamex和Papain酶解產物肽分子量變化見圖 3。

圖 3 擠壓處理前后小麥面筋蛋白 Protamex(A)和 Papain(B)酶解產物的肽分子量分布

由圖 3可以看出：預處理前后的面筋蛋白酶解液的肽分子量分布圖譜變化顯著,擠壓后兩種酶解產物中大分子量肽占總肽量比值明顯減少,而小分子量肽占總肽量比值增加,這表明擠壓預處理后小麥面筋蛋白的結構更適合蛋白酶的酶解。此外, Protamex酶解產物肽分子量分布的較均勻,而 Papain酶解產物肽分子量相對來說更趨向于集中在某一分子段內,從而說明 Protamex酶能對分子內部較多的位點起作用,肽的分子量更小。

由表2中不同酶解產物中各肽段占總肽量的比例可以看出,擠壓預處理后,Protamex和 Papain酶解產物中分子量大于 5000Da肽段含量顯著降低,分別降低了75.2%和 80.8%,酶解產物中分子量介于 1000～5000Da間肽段則有所增加;分子量 120～1000Da肽段大幅度增加,分別增加了 101.7%和 116.9%。此外,擠壓處理后,面筋蛋白 Protamex和 Papain酶解產物中分子量 ＜120Da的肽段也分別增加了 49.0%和 62.0%。這些結果說明大部分難以酶解的小麥面筋蛋白組分被降解,原因是擠壓處理導致了小麥面筋蛋白結構發生變化和重排,而重排后的面筋蛋白結構更有利于酶解[15]。

2.4 擠壓后小麥面筋蛋白酶解液氨基酸組成的變化

小麥面筋蛋白富含谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸,這是小麥面筋蛋白結構不同于其它蛋白的原因之一[17]。蛋白質在酶解過程中被降解成多肽、寡肽和游離氨基酸,對呈味有很大貢獻的是酶解產物中的寡肽和游離氨基酸。小麥面筋蛋白富含 Glu,因此酶解液中主要以鮮味為主。二肽也是酶解液中的風味物質,其風味特性與氨基酸的組成密切相關。提供鮮味的二肽中一般都含有 Glu或Asp,如魚蛋白酶解物 Glu-Glu、Glu-Ser、Thr-Glu、Glu-Asp等和酸性肽Gly-Asp、Ala-Glu、Glu-Leu等都具有鮮味的特性[18]。

由圖 3酶解產物肽分子量分布的結果可知, Protamex酶解液肽的分布更為豐富,于是選擇擠壓預處理小麥面筋蛋白 Protamex酶解產物進行氨基酸及游離氨基酸分析,結果見表 3。擠壓預處理前后小麥面筋蛋白 Protamex酶解液中游離氨基酸含量偏低,分別為 329.85mg/100mL和841.12mg/100mL,僅占全部氨基酸的 5.0%和 14.3%,說明酶解過程中產生的酶解產物主要以肽為主,但擠壓處理則可以顯著提高游離氨基酸含量。酶解液中游離 Leu和 Phe含量最高,分別為 19.68%和 11.44%,擠壓預處理使得這兩種游離氨基酸的含量分別降為 14.56%和 9.47%。此外,小麥面筋蛋白的氨基酸中含量最高的 Glu和Pro,在酶解液的游離氨基酸比例中并不占優勢。小麥面筋蛋白中鮮味氨基酸預處理前后分別為50.15%和 51.98%,而酶解液中游離的鮮味氨基酸僅有15.74%,雖說擠壓后的酶解液中游離鮮味氨基酸的比例又下降到 10.85%,但是游離鮮味氨基酸的總量則提高了 40.4%。因此,酶解液中的鮮味氨基酸并未游離出來,有一部分以鮮味肽的形式存在。預處理后各個氨基酸游離部分與全部氨基酸的比例有所變化,說明擠壓預處理后酶解位點發生了改變,有利于更好地進行控制性深度酶解。

2.5 擠壓處理后小麥面筋蛋白酶解產物風味的變化

以表 1為標準,對擠壓處理前后的酶解產物進行鮮味評分,結果見表 4。對兩種不同的酶解產物而言,擠壓預處理后可以使得酶解產物的鮮味更加突出。結合表2和表3的分析結果說明,酶解液中的鮮味物質是以小分子肽和游離氨基酸為主。經過擠壓處理后,小麥面筋蛋白酶解產物鮮味氨基酸含量的增加,從而達到了其風味閾值,亦或是游離氨基酸之間、氨基酸和小分子肽之間的協同作用而使得擠壓處理后酶解產物的鮮味更加突出。

表 3 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物的氨基酸組成

注：鮮味氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和絲氨酸之和;括號內數值為單個氨基酸含量占總氨基酸量的百分數。

表 4 擠壓預處理前后小麥面筋蛋白酶解產物的鮮味評分值

3 結論

擠壓預處理可以顯著改變小麥面筋蛋白的酶解特性。擠壓預處理后,小麥面筋蛋白酶解產物的水解度提高了 77%～122%,蛋白質回收率則下降了7.5%～12.2%;高分子量的肽組分比例顯著減少,低分子量的肽組分比例則明顯增加;氨基酸組成發生了明顯的變化,游離氨基酸含量顯著增加;酶解產物鮮味增強,酶解液中的鮮味成分主要以小分子肽和游離氨基酸為主。因此,擠壓預處理是一種輔助提高小麥面筋蛋白酶解效率和酶解產物呈味強度行之有效的方法。

[1]Payne P I,Nightingale M A A,Krattiger F,et al.The relationship between HMW glutenin subunit composition and the breadmaking quality ofBritish-grown wheat varieties[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1987,40：51-65.

[2]Lens J P,MulderW J,Kolster P.Modification ofwheat gluten for nonfood application[J].Cereal FoodsWorld,1999,44：5-9.

[3]康立寧,魏益民 .大豆蛋白及其組織化技術 [J].食品科學,2004,25(增刊)：112-116.

[4]Tolstoguzov V B.Thermoplastic extrusion-the mechanism of formation of extrudate structure and properties[J].Journal of the American Oil Chemists’Society,1993,70：417-423.

[5]Arrage J M,Barbeau W E,Johnson J M.Protein quality of whole wheat as affected by drum-drying and single-screw extrusion[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992, 40：1943-1947.

[6]Izzo H V,Lincoln M D,Ho C T.Effect of temperature,feed moisture,and pH on protein deamidation in an extruded wheat flour[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,41：199-202.

[7]LiM,Lee T C.Effect of extrusion temperature on solubility and molecular weight distribution of wheat flour proteins[J]. Journal ofAgricultural and Food Chemistry,1996,44：763-768. [8]Tkachuk R.Nitrogen to protein conversion factors for cereal and oilseed meals[J].Cereal Chemistry,1969,46：419-423.

[9]趙新淮,馮志彪 .蛋白質水解度的測定 [J].食品科學, 1994(11)：65-67.

[10]寧正祥 .食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業出版社,1998.

[11]Mahmoud M L,Malone W I,Cordle C T.Enzymatic hydrolysis of Casein.Effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical properties[J].Journal of Food Science,1992,57：1223-1229.

[12]大連輕工業學院,等 .食品分析 [M].北京：中國輕工業出版社,1994：223.

[13]Lioe H N,Apriyantono A,Takara K,et al.Low Molecular Weight Compounds Responsible for Savory Taste of Indonesian Soy Sauce[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2004, 52：5950-5956.

[14]王金水 .酶解-膜超濾改性小麥面筋蛋白功能特性研究[D].廣州：華南理工大學博士論文,2007.

[15]Ummadi P,Chenoweth W L,Ng P K W.Changes in solubility and distribution of semolina proteins due to extrusion processing[J].Cereal Chemistry,1995,72：564-567.

[16]Yin S W,Tang C H,Cao J S,et al.Effects of limited enzymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp(Cannabis sativa L.)protein isolate[J].Food Chemistry, 2008,106：1004-1013.

[17]Grosch W,W ieser H.Redox reactions in wheat dough as affected by ascorbic acid[J].JournalofCereal Science,1999,29：1-16.

[18]周秀琴 .日本天然調味料開發現狀 [J].中國調味品, 1993(11)：1-8.

Changes in enzymatic hydrolysis properties of wheat gluten treated with extrusion

ZHAO Ha i-feng1,CHA I Hua1,ZHAO M ou-m ing1,＊,CUIChun1,WANG Jin-shui2
(1.College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450052,China)

The Protam ex and Pap a in-induced hyd rolys is of whea t g luten w ith or w ithout extrus ion trea tm ent we re s tud ied in this p ap e r.Results showed tha t extrus ion trea tm ent resulted in s ignificant inc reases of77%～122% in deg ree of hyd rolys is and in um am i flavor and som ewha t dec rease in p rote in recove ry for whea t g luten enzym a tic hyd rolysa tes.Comp a red w ith na tive whea t g luten hyd rolysa tes,the re la tive p e rcentage of the p ep tides re leased from extruded whea t g luten w ith high and low m olecula r we ight dec reased and inc reased s ignificantly, resp ec tive ly.Results from am ino ac id ana lys is and m olecula r we ight d is tribution of p ep tides sugges ted tha t the flavor comp ounds in resulting hyd rolysa tes m a inly cons is ted of low m olecula r we ight p ep tides and free am ino ac ids.

extrus ion trea tm ent;whea t g luten;enzym a tic hyd rolys is p rop e rties;flavor

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0093-05

小麥面筋蛋白是小麥淀粉生產過程中的一種副產品,是大宗低值食物蛋白資源。小麥面筋蛋白因含有較多的疏水性氨基酸、分子體積及分子內疏水作用區域較大等原因,使得其在水中溶解性差,導致其功能特性無法與其它蛋白競爭,制約了其在食品和非食品領域的應用[1-2]。改性尤其是酶解改性是改善小麥面筋蛋白功能特性的核心技術,此外,由于小麥面筋蛋白分子中鮮甜味的氨基酸含量豐富,采用深度酶解技術制備鮮味特征明顯的呈味基料,是小麥面筋蛋白深加工的一個重要途徑。但小麥面筋蛋白在酶解過程中尚存在一些諸如水解度低、水解速度慢、水解時間長、水解效率低等問題,因此,尋求小麥面筋蛋白高效酶解技術是小麥面筋蛋白改性的關鍵。利用雙螺桿擠壓機對小麥面筋蛋白進行擠壓處理,蛋白質在高溫、高壓和剪切的綜合作用下,發生一系列復雜的物理化學反應,導致維持蛋白質三、四級結構的結合力變弱,使蛋白質分子呈線性定向排列[3],由球狀聚集態重組為纖維狀,發生變性,提高酶解敏感性[4]。以前研究多集中在擠壓處理對蛋白質功能特性的影響[5-7],而擠壓處理后小麥面筋蛋白酶解產物特性的變化尚未見報道,而闡明該機理對于提高小麥面筋蛋白酶解效率、改善其功能特性具有重要的理論和實踐意義。因此,本文旨在研究擠壓預處理后小麥面筋蛋白酶解產物特性的變化,考察擠壓預處理是否可以提高小麥面筋蛋白的酶解效率和提高酶解產物的呈味能力,為小麥面筋蛋白深加工呈味基料提供理論和方法的指導。

2009-04-13 ＊通訊聯系人

趙海鋒(1977-),男,講師,博士,研究方向：發酵工程、食品生物技術。

國家自然科學基金 (200676044);國家新技術研究發展(863)計劃(2006AA10Z326)。