食用塊菌形態特征和抗氧化性能研究

陳毅堅,鐘文武,余正云

(1.云南民族大學化學與生物技術學院,云南昆明 650031; 2.西雙版納職業技術學院,云南西雙版納 666100)

食用塊菌形態特征和抗氧化性能研究

陳毅堅1,鐘文武1,余正云2

(1.云南民族大學化學與生物技術學院,云南昆明 650031; 2.西雙版納職業技術學院,云南西雙版納 666100)

對產于云南的塊菌的形態特征進行了研究,觀察了子實體、子囊孢子的形態,并將塊菌的水提取液和醇提取液進行了清除DPPH自由基、清除超氧負離子自由基、清除羥基自由基的抗氧化性能實驗。結果表明,塊菌有大而壁厚的子囊孢子,人工培養時不易萌發。塊菌的水提取液和醇提取液都有較好的抗氧化性能,醇提取液的抗氧化性能優于水提取液。

塊菌,共生型真菌,形態特征,抗氧化性能

1 材料與方法

1.1 實驗材料

云南塊菌 購自匯和公司,標本經鑒定后儲存于云南民族大學化學與生物技術學院微生物實驗室;云南塊菌不同溶劑提取物 a.蒸餾水提取液 (將10g塊菌子實體切碎,加入 50mL蒸餾水,沸水浴加熱20min,過濾備用);b.50%醇提取液 (將 10g塊菌子實體切碎,加入 50mL 50%的乙醇溶液,室溫下浸泡一周,過濾備用);c.95%醇提取液 (將 10g塊菌子實體切碎,加入 50mL 95%的乙醇溶液,室溫下浸泡一周,過濾備用);鮮松針培養基 洋芋 20%、鮮松針 3%、麥芽糖1%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、MgSO40.05%、瓊脂 2%;PDA培養基 200g馬鈴薯、葡萄糖10～20g、瓊脂 17～20g、水 1000mL;鄰二氮菲,H2O2, FeSO4,磷酸鹽緩沖液,Tris-HCl緩沖液,鄰苯三酚, DPPH。

1.2 實驗方法

1.2.1 塊菌生境和形態描述[12]通過查閱文獻資料了解塊菌的生態環境特征;觀察描述子囊果特征和徒手切片法制子囊孢子顯微玻片觀察其形態特征和生長狀況。

1.2.2 分離培養

1.2.2.1 塊菌組織塊接種培養 將塊菌子實體用70%酒精泡洗數次,再用無菌水沖洗數次,切成 0.5～1.0cm大小,接種于鮮松針和 PDA固體培養基上,于28℃的溫箱中培養,觀察生長狀況。

1.2.2.2 孢子懸浮培養 將用石英砂研磨塊菌子實體后離心得到的孢子懸液分別接種于鮮松針液體培養基(pH=7.2～7.4)和 PDA液體培養基 (pH=7.2～7.4)中懸浮培養,搖床轉速 120r/min,23～25℃,培養一周后定期進行鏡檢,觀察其生長狀況。

1.2.3 塊菌提取液抗氧性能的研究

1.2.3.1 提取液清除DPPH·的實驗[13-14]配制塊菌水提取液,50%乙醇提取液,95%乙醇提取液備用,同時配制 0.0177mmol/L的 DPPH溶液,避光保存備用。分別取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL不同溶劑提取的提取液于試管中,加 2mL所配制的DPPH溶液,混合均勻,補充體積至 4mL,30min后倒入光徑為1cm的比色皿中,在 517nm處測定其吸光度值,同時測定提取液樣品空白以及不加提取液的空白樣的吸光度值。按下式計算其對DPPH的抑制率：

抑制率 (%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

其中：Ai=2mL DPPH溶液 +提取液的吸光度值;Aj=2mL提取液 +2mL乙醇的吸光度值;A0= 2mL DPPH溶液 +提取溶劑的吸光度值。

1.2.3.2 提取液清除超氧負離子自由基的實驗[15]取 5.6mL Tris-HCl緩沖液于試管中,加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液混勻后,25℃的水浴鍋中保溫 10min,取出后立即加入在 25℃水浴鍋中預熱的鄰苯三酚 0.3mL,迅速搖勻,倒入光徑為 1cm比色皿,每隔 30s測定吸光度 1次,平行測定 3次,取平均值,計算抑制率,同時做空白實驗。

抑制率(%)=(A樣-A0)/A0×100%

1.2.3.3 提取液清除羥基自由基的實驗[16]在試管中分別加入 2mL pH7.4的磷酸鹽緩沖液,1mL 1.5mmol/L的鄰二氮菲溶液,充分混勻后加入 1mL 1.5mmol/L的 FeSO4溶液,加入后立即混勻,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL的提取液,混勻后再加入 1mL 0.02%～0.03%的 H2O2,最后補充體積至8mL,同時做樣品空白和試劑空白 (A0),于 37℃保溫1h,測定 510nm下的吸光度,重復 3次,計算平均值。

OH-的清除率 (%)=(A樣-A0)/A0×100%

式中：A樣為提取液并扣除樣品空白后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 塊菌生態環境特征及形態特征

實驗材料采自云南楚雄永仁,塊菌子實體生于云南松 (Pinas yunnanensis)、高山松 (Pinas densata)、麻 櫟 (Quercus acutiss im a)、高 山 櫟 (Quercus sem icarpifolia)、青岡櫟 (Cyclobalanopsis glauca)的混交林下土層中,土質疏松微砂粒化、瘠薄,含少量的腐殖質,平均氣溫 18～20℃,每年 11至次年 2月為采收期。

云南塊菌的子囊果 (子實體)多呈球形或半球形,直徑 1.5～3.5cm,單重 5.8～11.7g,黑褐色,表面布以大小不等的疣突,放置時發出濃郁的香甜氣味,子囊果質硬,較耐儲存,采收后可埋于干沙中一段時間。切開子實體可見一些乳白色的菌脈,制徒手顯微切片觀察可見塊菌的子囊較大,一般含有 2、3或 4個孢子,子囊孢子橢圓形,大小為 32～48×21～35μm,褐色,表面有較多的突起,有較厚的孢子壁,結果見圖1。

圖 1 菌子囊及子囊孢子(a～d)和菌在液體培養液中孢子的生長狀態塊(e、f)

2.2 分離培養實驗結果

通過比較塊菌組織塊接種培養和孢子分離培養的結果,可見塊菌組織塊在固體培養基上不易生長,培養物極易被污染,這與塊菌為共生菌有關。而孢子分離懸浮于松針培養基中培養的有絮狀沉淀產生,鏡檢觀察后,發現有無性孢子產生,直徑大小為8～11μm。

2.3 塊菌提取液抗氧化性能的研究

2.3.1 塊菌提取液清除DPPH自由基的實驗 用不同溶劑的塊菌提取液做清除DPPH自由基的實驗,依據公式計算出抑制率,不同溶劑不同濃度提取液的清除效果見圖2。

由圖 2可知,塊菌水提取液和 95%的乙醇提取液對 DPPH自由基有較好的清除效果 (最高值達80%),隨著濃度的增加清除率也在增加;且在低濃度的范圍內,清除率的增加幅度較大,當濃度增加到一定時,清除率增加不明顯。50%的乙醇提取液對DPPH自由基的清除效果相比而言明顯低于水提液和 95%乙醇提取液的清除效果。

圖2 塊菌不同溶劑提取液清除DPPH·結果示意圖

2.3.2 塊菌提取液清除超氧負離子自由基的實驗不同溶劑塊菌提取液清除超氧負離子自由基的結果見圖3。

圖3 塊菌不同溶劑提取液清除超氧負離子自由基結果示意圖

由圖 3可知,塊菌 50%乙醇提取液對超氧負離子自由基幾乎沒有清除效果,而在水提液和 95%乙醇提取液中,95%的乙醇提取液對超氧負離子自由基的清除效果較好,在較低濃度下,清除率增加的幅度較小,而隨著濃度的增加,清除率也明顯增大。實驗表明,水提取液和 95%乙醇提取液對超氧負離子自由基的清除能力為：95%乙醇提取液 ＞水提取液。

2.3.3 塊菌提取液清除OH自由基的實驗 塊菌不同溶劑提取液清除羥基自由基的結果見圖 4。

圖 4 塊菌不同溶劑提取液清除OH·自由基結果示意圖

由圖 4可知,塊菌水提取液、50%乙醇提取液和95%乙醇提取液對羥基自由基都有較好的清除效果(最高值達 80%以上),在較低濃度下清除率增加幅度較大,而在較高的濃度下,清除率增加不明顯。95%和 50%的乙醇提取液在加入體積 0.5mL時有相同的抑制率。

3 討論

通過觀察塊菌的子囊果的孢子的形態特征可以得知,塊菌的子囊孢子有較厚的孢子壁,普通的固體培育法不易使孢子萌發,懸浮培養時孢子易萌發,因此提示我們,采用人工和半人工模擬栽培時可使用懸浮培養的孢子懸液作為接種劑可取得較好的效果。

通過塊菌不同溶劑提取液抗氧化性能不同測定方法的比較研究,可看出不同溶劑的塊菌提取物都有較好的抗氧化效果,而醇溶劑的提取物效果較好,因此對塊菌的食用加工方面,可制作出保健酒或酒精飲料等產品,以提高塊菌資源利用的附加值。在今后的進一步研究中,將對塊菌活性成分進行深入的研究,可將其活性成分提取純化出來,并鑒定其結構,用做其它食品或化妝品的添加物,還可開發為抗腫瘤、抗衰老、調節免疫功能的藥物等,這將對我省塊菌資源的可持續利用和天然抗氧化劑的開發有著積極的作用。

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Study on morphological character and antioxidant activity of edible truffle

CHEN Y i-jian1,ZHONGW en-wu1,YU Zheng-yun2
(1.College of Chemistry and Biological Technology,Yunnan University of the Nationalities,Kunming 650031,China; 2.Xishuangbanna College of Professional Technology,Xishuangbanna 666100,China)

The m orp holog ica l cha rac te r of ed ib le truffle was s tud ied through the obse rva tion of fruiting body and ascosp ore in this p ap e r,and its antioxidant ac tivity was a lso s tud ied by tes ting c leaning DPPH·free rad ica l, sup e roxide rad ica l and hyd roxy rad ica lw ith the wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle.The result showed tha t truffle ascosp ore had la rge and thick wa ll,which p revented from its ge rm ina tion in a rtific ia l culture.The wa te r extrac t and the a lcohol extrac t of truffle both have be tte r antioxidant ac tivity,and the a lcohol extrac t is sup e rior to the wa te r extrac t in antioxidant ac tivity.

truffle;sym b iotic fungus;m orp holog ica l cha rac te ris tic;antioxidant ac tivity

TS219

A

1002-0306(2010)02-0139-03

塊菌是真菌綱 (Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、塊 菌 目 (Tuberales)、塊 菌 科(Tuberaceae)、塊菌屬 (Tuber)[1]的外生菌根型真菌。迄今全球描述的塊菌屬真菌在 60種以上,主要分布在北溫帶的森林地區和南溫帶的森林地區,少數分布在干旱的荒漠、半荒漠地帶和亞熱帶林區。歐洲地區是塊菌的發祥地,法國、意大利、西班牙等為塊菌的主要分布區。塊菌在中國主要分布在西南的四川和云南,海拔 1600～2600m的針闊混交林或針葉林下,以及西北的新疆和西藏等地[2]。到目前為止,在我國發現的塊菌種類估計有 25種之多。塊菌有很高的營養價值和多種藥物功能,近年來有很多的研究報道其所含活性成分有α-雄烷醇、神經酰胺、塊菌多糖等,這些化合物具有抗腫瘤、免疫調節、保肝、抗衰老等活性,塊菌的這些良好保健作用也因此受到了人們的關注[3-11]。但由于塊菌是菌根共生型真菌,有特殊的生境要求,故產量少,目前出口需求量大,我們云南省的一些貿易公司每年都向產地收購后直接出口歐洲國家,對塊菌資源的利用較粗放,這不利于資源的保護和有較高經濟價值的利用。本文開展對塊菌的生物學特性和抗氧化性能的比較研究,為探究塊菌抗衰老、保肝健體的機理,也為今后更好地利用塊菌資源,開發附加值較高的保健產品提供基礎資料。

2009-03-10

陳毅堅(1966-),女,副教授,研究方向：微生物資源的開發和利用。