離子液體中米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成蔗果三糖的研究

毛多斌,王 雪,2,韓亞偉

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002; 2.深圳波頓香料有限公司,廣東深圳 518051)

離子液體中米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成蔗果三糖的研究

毛多斌1,王 雪1,2,韓亞偉1

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002; 2.深圳波頓香料有限公司,廣東深圳 518051)

對(duì)來自于米曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶在離子液體中催化蔗糖反應(yīng)生成蔗果三糖的過程進(jìn)行了研究。考察了鹽平衡、底物蔗糖和酶量的比率、溫度、時(shí)間、pH、離子液體和酶量的比率對(duì)催化得率的影響,其中離子液體的水活度采用鹽的高水合物和低水合物組成的水合鹽進(jìn)行控制。結(jié)果表明,最優(yōu)的催化反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度 40℃,pH6.2,底物濃度60%,反應(yīng)時(shí)間 24h。關(guān)于離子液體與酶的重復(fù)利用方面,離子液體性質(zhì)和酶的催化活力有待于進(jìn)一步研究。

米曲霉,蔗果三糖,果糖基轉(zhuǎn)移酶,離子液體

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米曲霉 (Aspergillus oryzae) 源于本實(shí)驗(yàn)室;蔗糖(純度 ＞99.9%) 分析純,購于 Sigma公司;蔗果三糖標(biāo)樣 (純度 ＞96%) 購于 Sigma公司;離子液體 1-丁基 -3-甲基-咪唑六氟磷酸鹽 ([BM IM] [PF6])、1-丁基-3-甲基-咪唑雙三氟甲黃酰亞胺鹽([BM IM][Tf2N])、1,3-二甲基咪唑硫酸鹽([MM IM][MeSO4])、1-丁基-3-甲基-咪唑雙氰銨鹽([BM IM][DCN]) 分別購于 Sigma公司和上海成捷化學(xué)試劑公司;檸檬酸-磷酸緩沖液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 將米曲霉菌體接種到種子培養(yǎng)基[4](查氏培養(yǎng)基：NaNO32g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蔗糖 30g、蒸餾水 1000mL, 121.5℃、0.1MPa滅菌 20min)中,28℃的生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 48h。再用接種環(huán)挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落,在超凈工作臺(tái)里接種到液體培養(yǎng)基 (小麥麩皮培養(yǎng)基：200g小麥麩皮煮沸 30min的濾出液,定容至 1L,自然pH;121.5℃、0.1MPa滅菌 20min)中,28℃的生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為 170r/min,培養(yǎng)時(shí)間 48h。

將各菌懸液冰浴 30min,在 4℃條件下, 10000r/min離心 20min,收集上清,即為粗酶液,保存在-20℃條件下備用。

1.2.2 超濾 粗酶上清粗略計(jì)算為 120mL,孔徑為30kD的超濾膜裝好于超濾杯中,無氣泡,用無菌水清洗幾次,冰浴條件下,打開抽濾泵,用液氮保護(hù)超濾,超濾時(shí)間約 4h,超濾后體積剩余為 10mL,切記最后關(guān)掉抽濾泵,以免倒吸。

將超濾后粗酶保存在-20℃條件下備用。清洗超濾膜及超濾杯,泡在 5%甲醛溶液中,和超濾杯保存在 4℃條件備用。

1.2.3 酶含量測(cè)定 用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法 (Bradford法)[4]測(cè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1。

圖1 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖 1可以得出酶蛋白的濃度,并經(jīng)超濾前后酶活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)得出,超濾后高于超濾前的反應(yīng)活性,且酶易于保存,所以以下采用的均為超濾后的酶液。

1.2.4 反應(yīng)體系條件建立 分別取離子液體[BM IM][PF6]、[BM IM][Tf2N]、[BM IM][DCN]、[MM IM][MeSO4]各 500μL,再各加入 1000μL超濾后的酶液加入到 10mL反應(yīng)容器中,4℃條件下平衡約 5h[5-8]。

做與平衡對(duì)比實(shí)驗(yàn)：條件同上,未加鹽的條件下,依次分別加離子液體、酶及蔗糖后未預(yù)平衡直接反應(yīng)。

各加入該反應(yīng)容器中約 60%蔗糖,40℃條件,恒溫水浴搖床反應(yīng) 24h后[9],100℃煮沸 10min滅酶活終止反應(yīng),將反應(yīng)體系溶液稀釋 200倍保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 測(cè)定方法

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備 分別稱取 10mg的果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖溶于雙蒸水并定容至 10mL,制成四種糖的混合溶液(終濃度均為 1.0mg/mL)。

1.2.5.2 樣品處理方法 酶反應(yīng)后的反應(yīng)液離心除去沉淀蛋白質(zhì)等,用雙蒸水稀釋上清液到相應(yīng)濃度(以下樣品均稀釋 200倍),再將稀釋液用微孔濾膜過濾后供 HPLC分析用[10-11]。

1.2.5.3 高效液相色譜方法 檢測(cè)儀器為：高效液相色譜儀和蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀;HPLC條件：色譜柱為D-sugar柱 (0.5×25cm),流動(dòng)相為乙腈-水 (80∶20),流速 1.0mL/min,進(jìn)樣量 15μL,柱溫 30℃,管溫80℃,分析時(shí)間 25min,對(duì)照品為蔗果三糖 (GF2)、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)品。

2 結(jié)果及討論

2.1 標(biāo)樣

圖2 標(biāo)準(zhǔn)糖液HPLC圖譜

2.2 鹽平衡條件下酶的催化

水含量是影響酶活力的關(guān)鍵因素,絕對(duì)無水或過少量的水都不足以使酶分子形成其活性構(gòu)象,也就沒有催化活性[12]。我們用預(yù)平衡的方法控制初始水活度。我們配制了不同濃度及 pH的緩沖液,從圖可以看出,在使用鹽的飽和水溶液來預(yù)平衡時(shí),當(dāng)用pH6.2磷酸-檸檬酸緩沖液控制初始水活度時(shí)獲得了較高的產(chǎn)率。這可能是適當(dāng)水分子的存在降低了酶分子內(nèi)部強(qiáng)極性基團(tuán)間的靜電相互作用,使酶分子具有足夠的柔性,能夠處于催化作用所必需的構(gòu)象狀態(tài)。

鹽預(yù)平衡與未平衡對(duì)比結(jié)果如圖 3、圖 4。

圖3 粗酶反應(yīng)未平衡

圖4 鹽平衡5h后的反應(yīng)

由圖 3、圖 4比較得出,鹽平衡后反應(yīng)中有較多產(chǎn)物蔗果三糖生成,說明鹽平衡后對(duì)反應(yīng)更有利。結(jié)果表明,鹽平衡 5h后的反應(yīng)體系中有較多的目的產(chǎn)物生成,有利于反應(yīng)的酶活性提高,說明在反應(yīng)之前要預(yù)平衡 5h后最佳。

2.3 選擇最佳離子液體及條件優(yōu)化

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]的離子液體,結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)情況,選擇了以下幾種離子液體,[MM IM] [MeSO4]、[BM IM][PF6]、[BM IM][Tf2N]、[BM IM] [DCN]中在同樣條件下反應(yīng),作 HPLC結(jié)果反應(yīng)如圖5～圖8。

圖 5 在[BM IM][PF6]中反應(yīng)

圖 6 在[MM IM][MeSO4]中反應(yīng)

圖 7 在[BM IM][Tf2N]中反應(yīng)

圖8 在[BM IM][DCN]中反應(yīng)

由圖 5～圖 8可以看出,同樣反應(yīng)條件下,在[BM IM][PF6]中反應(yīng),有較多產(chǎn)物蔗果三糖生成,酶在反應(yīng)中活性較高,且產(chǎn)物中雜質(zhì)少。在[MM IM] [MeSO4]和[BM IM][Tf2N]中反應(yīng),生成目的產(chǎn)物較少,需進(jìn)一步優(yōu)化適宜條件,而在 [BM IM][DCN]中反應(yīng),無目的產(chǎn)物生成。

結(jié)果表明,500μL[BM IM][PF6]和 1000μL酶液,250μL[MM IM][MeSO4]和 750μL酶液反應(yīng)體系中有較多目的產(chǎn)物生成,而通過這兩者的對(duì)比以及以上四者的對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn),在[BM IM][PF6]中反應(yīng)最佳,效果較好,目的產(chǎn)物生成較多。β-果糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為 40℃,在小于 45℃范圍,該酶活力保持很好。果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)pH為 5.0～6.0的偏酸環(huán)境,在 pH為 5.5～7.5時(shí),果糖基轉(zhuǎn)移酶活力保持較好,反應(yīng)時(shí)間為 6～24h,水浴搖床反應(yīng)條件下為宜。

當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中緩沖液 pH6.2時(shí),β-果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖的反應(yīng)產(chǎn)率較高;當(dāng)?shù)孜镎崽呛繛?0%,濃度為 3.591g/L酶液 1mL,離子液體[BM IM] [PF6]為 0.5mL,40℃反應(yīng)經(jīng)過 6h,反應(yīng)產(chǎn)物較多,反應(yīng) 24h后產(chǎn)品沒有太大變化,但葡萄糖含量增加,通過研究獲得了較好的反應(yīng)條件：pH6.2,溫度為 40℃,蔗糖含量為 60%,離子液體和酶液的物質(zhì)量比為0.5∶1,反應(yīng) 6h。同時(shí)通過對(duì) 24h不同時(shí)間梯度條件下反應(yīng)的考察,發(fā)現(xiàn)離子液體體積和酶的催化活力都沒有明顯減少,酶和離子液體都顯示了良好的反應(yīng)性能。

2.4 離子液體中反應(yīng)的優(yōu)越性

離子液體作為酶催化反應(yīng)的溶劑使用方式有三種：第一,和水一起作混合溶劑;第二,單純作溶劑;第三,和其他非水溶劑組成兩項(xiàng)體系。利用離子液體可以解決一些水和有機(jī)溶劑不能解決的問題。例如,不同陰陽離子的離子液體,物理性質(zhì)不一樣,可以增加酶和一些反應(yīng)底物(如碳水化合物等)的溶解度,解決某些物質(zhì)在有機(jī)溶劑中不能充分溶解的問題;通過酶在離子液體中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)控制,可以使一些反應(yīng)具有更高的選擇性;某些在一般有機(jī)溶劑中沒有活性或活性較低的酶 (如水解酶),其在離子液體中反應(yīng)較好地保持了其活性[16]。

水相反應(yīng)和離子液體中反應(yīng)作對(duì)比如圖 9。

圖9 水相反應(yīng)和疏水性離子液體[BM IM][PF6]中反應(yīng)的對(duì)比

疏水性離子液體與親水性離子液體反應(yīng)作對(duì)比如圖10。

圖 10 疏水性離子液體[BM IM][PF6]與親水性離子液體[MM IM][MeSO4]反應(yīng)作對(duì)比

由圖 9可以看出,疏水性離子液體反應(yīng)體系中有較多目的產(chǎn)物蔗果三糖生成,結(jié)果表明,酶在離子液體中反應(yīng)要比在水相中反應(yīng)活性高,說明在疏水性離子液體中有利于提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移活性。而由圖 10可以進(jìn)一步看出,酶在疏水性離子液體中反應(yīng)要比親水性離子液體中反應(yīng)活性高,表明：在疏水性離子液體中,更有利于提高果糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)移活性,有利于目的產(chǎn)物生成。

總之,在疏水性離子液體中更有利于酶活性提高,對(duì)反應(yīng)更有利。

2.5 離子液體及酶的重復(fù)利用

離子液體的優(yōu)點(diǎn)之一在于它的蒸汽壓低、揮發(fā)少而對(duì)環(huán)境友好,且可以回收并進(jìn)行反復(fù)利用。由于離子液體的價(jià)格昂貴,限制了其廣泛應(yīng)用。有效回收并反復(fù)使用離子液體的方法是降低成本的關(guān)鍵。初步考察了水/[BM IM][PF6]體系中[BM IM] [PF6]的重復(fù)使用性能,但實(shí)際過程中發(fā)現(xiàn),由于離子液體[BM IM][PF6]具有很高的黏度,很難通過過濾來達(dá)到與固定化酶的分離?？梢灶A(yù)見,如果進(jìn)一步改進(jìn)離子液體的回收方法,可以更好地實(shí)現(xiàn)離子液體的循環(huán)使用。因此在不分離酶的情況下,多批次的間歇反應(yīng)能成為一種反復(fù)利用離子液體和酶的手段[17]。

由于反應(yīng)后采用了多次萃取來回收離子液體,效果不佳,且回收條件不成熟,關(guān)于離子液體與酶的回收利用有待于做進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶在離子液體中能有效催化蔗糖反應(yīng)生成蔗果三糖,連接 1→2糖苷鍵,可通過在離子液體中控制水含量的方法調(diào)節(jié)反應(yīng),而結(jié)果顯示出在[BM IM][PF6]中反應(yīng)最佳,效果較好,目的產(chǎn)物生成較多,β-果糖基轉(zhuǎn)移酶最佳反應(yīng)條件為：pH6.2,溫度為 40℃,蔗糖含量為 60%,離子液體和酶液的物質(zhì)量比為 0.5∶1,反應(yīng) 6h。

同時(shí)對(duì)離子液體的循環(huán)使用進(jìn)行了初步研究,今后將進(jìn)一步研究離子液體的回收方法,以提高其循環(huán)使用性能。由于離子液體有無毒、不揮發(fā)和易分離等“綠色溶劑”的特點(diǎn),因此水/離子液體兩相體系中米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶可催化 1→2糖苷鍵連接,并進(jìn)一步對(duì)于合成蔗糖酯將展示出了良好的工業(yè)化應(yīng)用前景[17]。

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GF2(l-Kestose)synthesis by fructosyltransferase from Aspergillus oryzaecatalyzed in ionic liquid

MAO Duo-bin1,WANG Xue1,2,HAN Ya-wei1
(1.Food and Biological Engineering Institute,Zhengzhou University ofLight Industry,Zhengzhou 450002,China; 2.Shenzhen Boton Flavours&Fragrances Co.,Ltd.,Shenzhen,518051,China))

Fruc tosyltransfe rase from Asp e rg illus oryzae transfe rca tion of GF2(l-Kes tose)w ith suc rose in ionic liquid was inves tiga ted.Effec ts of sa lt ba lance,the ra tio of suc rose to enzym e,temp e ra ture,t im e,pH,the ra tio of ionic liquid to enzym e on the reac tion we re exam ined.The wa te r ac tivity in ionic liquid was controlled by sa lt hyd ra te p a irs.The results showed tha t the op t im um yie ld was ob ta ined a t40℃,pH6.2,the subs tra te concentra tion was 60%,reac tion t im e was24hours.The s tudy on the reuse of ionic liquid and enzym e,the p rop e rties of ionic liquids and ac tivities of the enzym e we re wa iting for inves tiga ted.

Asp e rg illus oryzae;GF2(l-Kes tose);fruc tosyltransfe rase;ionic liquid

TS202.3

B

1002-0306(2010)02-0300-04

早在 1914年[1]就發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)離子液體——硝基乙胺,但其后此領(lǐng)域的研究進(jìn)展緩慢,直到 1992[2]年,W ilkes領(lǐng)導(dǎo)的研究小組合成了低熔點(diǎn)、抗水解、穩(wěn)定性強(qiáng)的 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體 ([em im][BF4])后,離子液體的研究才得以迅速發(fā)展,隨后開發(fā)出了一系列的離子液體體系。離子液體作為一種新型的對(duì)環(huán)境友好的綠色溶劑,具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性高,可以針對(duì)不同物化性質(zhì)要求設(shè)計(jì)合成等優(yōu)點(diǎn),已替代有機(jī)溶劑作為許多種化學(xué)反應(yīng)的介質(zhì)[3]。離子液體的獨(dú)特結(jié)構(gòu),可以使酶懸浮在離子液體中從而大大降低酶的失活率,提高了酶熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、立體選擇性和對(duì)映體選擇性。離子液體中酶催化反應(yīng)的機(jī)理雖不甚明確,但是可以通過離子液體中酶催化反應(yīng)的一些特殊性質(zhì)得出一些初步的合理解釋,從而有利于離子液體作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)一步研究。近些年來對(duì)離子液體中果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)研究還未見報(bào)道。本研究就以蔗糖為底物,對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶在離子液體中催化合成蔗果三糖的反應(yīng)進(jìn)行了探討。

2009-03-17

毛多斌(1962-),男,教授,研究方向：煙草化學(xué)與香精香料。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20676127)資助;鄭州輕工業(yè)學(xué)院重大預(yù)演基金(xyyjj02)。