食品中性激素多組分殘留分析方法的概述

虞 淼,吳淑春

(1.浙江省農產品質量監督檢驗測試中心,浙江杭州 310020; 2.浙江醫學高等?？茖W校,浙江杭州 310053)

食品中性激素多組分殘留分析方法的概述

虞 淼1,吳淑春2

(1.浙江省農產品質量監督檢驗測試中心,浙江杭州 310020; 2.浙江醫學高等?？茖W校,浙江杭州 310053)

綜述了最近報道的關于應用色譜法檢測食品中性激素多組分殘留的分析方法。首先對性激素作簡短的介紹,然后著重概述了性激素多組分殘留的分析方法,包括樣品的提取、純化和各種不同的檢測方法,并對各種不同的分析方法進行詳細闡述。最后總結了性激素多組分殘留檢測方法的發展趨勢。

性激素,多組分殘留,分析方法

2 性激素多組分殘留檢測方法

在一定范圍內,性激素作為獸藥使用在法律上是允許的,但作為動物的生長促進物質是被嚴格禁止的。近年來,人們又把目光投向了食品中性激素的殘留情況,包括各種肉制品,動物內臟,乳制品等。因此,就需要有不斷發展的關于性激素多組分殘留的檢測方法。同時由于食品中性激素的痕量殘留(ng～μg·kg-1)和食品基質本身的復雜性,這就要求這些檢測方法不但要具有很高的靈敏度,并且要具有相應合適的性激素殘留的提取和純化方法。

從報道的文獻來看,主要還是集中在肉制品中性激素多組分殘留的分析檢測,并出現了一系列關于肉制品中性激素多組分殘留檢測的方法[4-8,10]。但是對于腎臟、肝臟和乳制品[11]中的性激素多組分殘留檢測方法的報道較少。

2.1 樣品的提取和純化

由于食品樣品基質的復雜性和性激素的痕量殘留 (ng～μg·kg-1),以及樣品提取和純化過程的復雜性,導致很多相應的檢測方法最后的回收率較低,這樣也使得食品中性激素多組分殘留的檢測變得很具有挑戰性。

一般來說,固體樣品(如腎臟、肝臟)先經粉碎或冷凍干燥或均質化后,再經有機溶劑提取,然后應用各種方法進行一系列的純化,如液液萃取 (LLE)、固相萃取(SPE)等。根據文獻報道,固相萃取是性激素純化過程中最常用的手段[6,8,10,12]。另外,也有報道其他的新方法如超臨界流體萃取 (SFE)在性激素提取純化過程中的應用[13,17]。

目前很多關于性激素殘留檢測方法都是針對食品中游離態性激素的。對于結合態的性激素,一般在樣品的處理過程中先使用 Helix pomatia液(含有β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶)[5,7-8,10]等酶解液對樣品進行水解,不過由于動物組織中結合態性激素可以被酶解的部分含量很低,因此使用 Helix pomatia液對樣品進行水解的有效性還存在很大的爭議。Har tmann和Steinhart[15]對使用酶解液進行酶解過程中性激素結構變化的可能性進行了討論,如孕烯醇酮轉變成孕酮。

最近的研究表明,動物組織中性激素的提取一般都使用甲醇作為提取劑[4,6,8],然而,Fuh[12]和Blasco[10]等指出使用乙腈作為提取劑能得到更純的提取物。Daeseleire[5]等在提取過程中則使用二乙醚作為提取劑。

對一個分析方法來說,粗提物的純化很關鍵,因為它直接關系到最后目標物質的檢測。從表 1中可以看出,SPE過程用到的吸附劑一般是 C8、Si-NH2、C18,通過使用這些特定的吸附劑,可以把不同性質的性激素一一分離[8,16]。

2.2 幾種先進的提取和純化技術

前面 2.1中提到的方法通常比較耗時、費力,同時需要大量的有機試劑,并且這些方法只能針對同一類或幾小類性激素的分析,因此,在這里介紹幾種可能用到的新的提取純化技術。

表1 GC-MS檢測樣品中性激素多組分殘留的方法

加速溶劑萃取 (ASE),也叫加壓液體萃取(PLE),它是一種在高溫高壓下對固體樣品提取的技術,該方法在環境化學和食品分析中應用較廣泛。這個方法最大的優點就是能減少試劑的用量和加快提取過程。雖然這是一項很有前途的技術,但在性激素多組分殘留分析過程中很少應用,幾乎未見有相關的文獻報道。

超臨界流體萃取(SFE),跟索氏提取法類似的一項技術,區別是提取過程中使用超臨界流體作為溶劑,最常用的超臨界流體是二氧化碳[13,17]。這項技術的最主要優點是高擴散率、低粘度和較小的表面張力。但關于在性激素殘留檢測過程中使用該技術的報道很少,就本人掌握的文獻有：Din[18]等使用該技術提取牛肉中的群勃龍;Huopalahti和 Henion[19]應用該技術對牛組織中七種雌激素進行提取。值得一提的是,該項技術目前還主要針對環境化學領域,而不是食品中痕量性激素殘留的分析。

固相微萃取(SP ME),該項技術的原理是利用被分析組分在樣品基質與提取劑中的分配不同,從而達到分離目的[17]。Ridgway[20]等提到,和溶劑提取相比,SP ME具有能減少溶劑的使用、同步完成提取、凈化和濃縮過程以及在樣品量很小的情況下也能處理等優勢。然而,到目前為止很少有關于該項技術應用于動物源固體食品中性激素提取的報道。

微波輔助提取 (MAE),它利用提取過程中對固體樣品的攪動和加熱從而提高提取的效率。由于它能縮短提取時間和減少試劑用量,因此比索氏提取更具有優勢。這項技術在環境樣品中應用很廣泛,比如從環境樣品中提取性激素、除草劑、苯酚、多環芳烴和多氯聯苯[21],但是還沒有關于該項技術應用于食品中性激素提取的報道。Her mo等[22]利用該項技術對豬肉中的喹諾酮殘留進行了提取。

2.3 性激素的檢測方法

過去的幾年中,主要是利用色譜 (GC或 LC)聯用高靈敏度的檢測系統,比如MS,對食品中性激素多組分殘留進行檢測,其中,又以 GC-MS或 GC-MS -MS(氣相色譜-質譜-質譜)應用最廣泛。然而,近年來,LC-MS(液相色譜-質譜)在性激素多組分殘留檢測中的應用越來越廣泛。這些色譜技術已經慢慢取代了原來的免疫法和薄層色譜法。

在過去,對于一些性激素的檢測主要是利用放射免疫法(R IA)和酶聯免疫法 (EL ISA)。如今,由于這些方法本身的局限性,如低靈敏度、不能滿足質量控制標準的要求,應用已經越來越少了。而 GC和LC由于它們的高靈敏度、高特異性,已經慢慢取代了上述方法。只有在一些特定物質的檢測上,如α-或β-群勃龍,依舊會用到高效薄層色譜(HPT LC)。

根據文獻報道,對于食品中性激素多組分殘留的分離和檢測最常用的技術就是氣相色譜串聯一級或多級質譜[MS(-MS)]。但是由于性激素本身的熱不穩定性和不易揮發性,因此在用氣相色譜檢測時,需要對性激素進行衍生化。從文獻中可以發現,對于性激素的衍生化,主要是利用各種不同衍生化試劑或衍生化試劑結合一系列催化劑對性激素分子結構中的羥基和/或酮基進行衍生化。幾乎所有的文獻中都提到了利用MSTFA(N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺)作為硅烷化衍生試劑,另外MSTFA+NH4I或MSTFA+T MSI或MSTFA+T M IS+DTE作為衍生化試劑同樣具有很好的效果[6,23-24],其中 NH4I、T MSI、T M IS等是作為催化劑的。Seo等[9]使用MSTFA+二硫赤蘚糖醇(DTE)+NH4I作為混合衍生試劑,這里DTE作為抗氧化劑。

如今,高效液相色譜串聯各種高靈敏度的檢測系統在性激素多組分殘留的分析中應用越來越廣泛,它具有高選擇性、高靈敏度和高特異性,最重要的是使用該技術,樣品不需經衍生化。此外,由于缺乏一種能對各種性激素都有效的普遍使用的衍生化試劑,也促進了各種基于液相色譜檢測性激素方法的發展,然而,各種檢測性激素殘留的 LC-MS方法都是針對環境樣品[25]或尿樣[26]的,相比與 GC-MS,應用 LC-MS檢測動物源食品中性激素殘留的很少[10,14,27],主要應用在檢測群勃龍類 (熱不穩定性)和康力龍(氣相色譜對其結構中的吡唑環具有強吸收)等性激素。另外,LC串聯各種MS(如離子阱或飛行時間質譜儀)技術使得分析檢測新的未知性激素成為可能,這些技術有望在未來幾年內更多地應用到食品中性激素多組分殘留的檢測中去。

3 結論

如今,由于生產方面的需要,更多的牲畜養殖戶會在養殖生產過程中多多少少使用一些合法的或違禁的藥物來促進牲畜的生長,而一些食品生產廠家為了獲取更多的經濟利益,也會在生產加工過程中添加一些添加劑,在這些藥物和添加劑當中也包括了各種性激素。由于好多藥物和添加劑的使用是受國家或國際上的相關法律法規嚴格控制的,因此有關方面也出臺了很多關于食品中性激素多組分殘留的檢測方法。

總體來說,在食品中性激素多組分殘留的檢測中,固相萃取以及 GC-MS應用最廣泛,然而,如今更多的焦點轉到了使用 LC-MS進行分析檢測。除此之外,更多尖端的提取純化技術和檢測技術也不斷發展起來,如超臨界流體萃取技術、飛行時間質譜儀等。而另外一些技術,如加速溶劑萃取、選擇性吸附劑等,由于新的性激素不斷出現,并且相關的設備很昂貴,則在性激素殘留分析中的使用受到越來越多的限制。

目前我國的食品安全狀況不容樂觀,最近的毒奶粉事件也反映出了我國在一些檢測技術和檢測標準上的滯后。而如今食品中性激素殘留的情況很普遍,雖然國家出臺了各種政策法規來遏制性激素進入飼養業而對人體造成危害,但各種違禁藥物還是屢禁不止。這主要是我國的標準體系不夠健全,而且現有的標準測定目標單一,檢測效率低下,檢測成本較大;另外我國的畜牧業生產大多數是以家庭飼養為主,飼養農戶大多數使用自己配制的飼料進行喂養,添加違禁藥物的行為很隱蔽,難以從飼料源頭進行控制。因此,探索一些高效快速的性激素多殘留檢測方法對食品安全質量控制、檢測效率的提高,以及檢測成本的降低具有重要的實際意義,同時對改善我國食品安全的狀況具有重要意義。

[1]StubbingsG W, Cooper AD, Shepherd MJ, etal. Determination of 19-nortestosterone and trenbolone in animal tissues by high-perfor mance liquid chromatography with immunoaffinity clean-up[J].Food Addit Contam,1998,15(3)：293-301.

[2]Sadao Nakamura,Tan Hwee Sian,Shigeki Daishima. Determination of estrogens in riverwater by gas chromatographynegative-ion chemical-ionization mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2001,919：275-282.

[3]崔曉亮,邵兵,趙榕,等 .超高效液相色譜-串聯電噴霧四極桿質譜法同時測定牛奶中 12種糖皮質激素的殘留[J].色譜,2006,24(3)：213-217.

[4]Hartmann S,H Steinhart.Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].ChromatogrBiomedAppl, 1998,704：105-117.

[5]Daeseleire E,Vandeputte R,Van Peteghem C.Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle[J]. Analyst,1998,123(12)：2595-2598.

[6] Impens S,De Wasch K,Cornelis M,et al.Analysis on residues of estrogens,gestagens and androgens in kidney fat and meatwith gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2002,970：235-247.

[7]湛嘉,李佐卿,俞雪鈞,等 .豬肉中 16種性激素的多殘留檢測方法[J].寧波大學學報：理工版,2007,20(4)：520-525.

[8]Marchand P,B Le Bizec,C Gade,et al.Ultra trace detection of a wide range of anabolic steroids in meat by gas chromatography coupled to mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2000,867：219-233.

[9]Seo J,H Kim,B C Chung,et al.Simultaneous determination of anabolic steroids and synthetic hormones in meat by freezinglipid filtration,solid-phase extraction and gas chromatographymass spectrometry[J].J ChromatogrA,2005：1067：303.

[10]Blasco C,C Van Poucke,C Van Peteghem.Analysis of meat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]J Chromatogr A, 2007,1154：230.

[11]Malekinejad H,P Scherpenisse,A A Bergwerf.Naturally occurring estrogens in processed milk and in raw milk(from gestated cows)[J].J Agric Food Chem,2006,54：9785.

[12]FuhM,S Huang,TLin.Determination of residual anabolic steroidsin meatby gas chromatography ion- trap mass spectrometer[J].Talanta,2004,64：408-411.

[13]StolkerA A M,PW Zoontjes,L A van Ginkel.The use of SFE for the Determination of Steroids in Animal Tissues[J].The Analyst,1998,123：2671-2676.

[14]Hooijerink H,vanBennekom EO,NielenM W F.Screening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry [J].Anal Chim Acta,2003,483(1-2)：51-59.

[15]Har tmann S,H Steinhart.S imultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hor mones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].Arch Lebensmittelhyg, 1997,48：111.

[16]Hartmann S,M Lacorn,H Steinhart.Natural occurrence of steroid hormones in food[J].Food Chem,1998,62：7-20.

[17]Kureckova K,B Maralikova,K Venture.Supercritical fluid extraction of steroids from biological samples and first experience with solid-phase microextraction-liquid chromatography[J].J ChromatogrB,2002,770：83.

[18]Din N,KD Bartle,A A Clifford,et al.Supercritical Fluid Extraction of Sulphamethazine and its Metabolites from meat tissues[J].J High Resol Chromatogr,1994,19：465.

[19]Huopalahti R P,J D Henion.The use of supercritical fluid extraction for the determination of steroids in cattle tissues[J].J Liquid Chromatogr Relat Technol,1996,19：69.

[20]Ridgway K,S P D Lalljie,R M Smith.Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods[J].J ChromatogrA,2007,1153(1)：36.

[21]Liu R,J L Zhou,A W ilding.Microwave-assisted extraction followed by gas chromatography-mass spectrometry for the determination of endocrine disrupting chemicals in river sediments [J].J ChromatogrA,2004,1038：19.

[22]Hermo M P,D Barrón,J Barbosa.Determination of residues of quinolones in pig muscle Comparative study of classical and microwave extraction techniques[J].Anal Chim Acta,2005,539：77.

[23]陳捷,秦燕,張美金 .氣相色譜-質譜法檢測動物肌肉組織中殘留的甾類同化激素[J].色譜,2006,24(1)：19-22.

[24]Maume D,B Le Bizec,PMarchand,et al.N-methyl-N-alkylsilyltrifluoroacetamide-I2 as a new derivatization reagent for anabolic steroid control[J].Analyst,1998,123(12)：2645.

[25]BarontiC,R Curini,GD’Ascenzo,et al.Monitoring natural and synthetic estrogens at activated sludge sewage treatment plants and in a receiving riverwater[J].Environ Sci Tech,2000, 34：5059-5065.

[26]Van Poucke C,M Van De Velde,C Van Peteghem. Combination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry for the detection of 21 anabolic steroid residues in bovine urine[J].J Mass Spectrom, 2005,40(6)：731.

[27]StolkerA A M,PW Zoontjes,P L W J Schwillens,et al. Determination of acetyl gestagenic steroids in kidney fat by automated supercritical fluid extraction and liquid chromatography ion-trap mass spectrometry[J].Analyst,2002,127：748-754.

Review of residualmulti-component analyticalmethods for the determination of steroid hormones in foods

YUM iao1,W U Shu-chun2
(1.Zhejiang Provincial Centre of Supervision and Testing ofQuality ofAgricultural Products,Hangzhou 310020,China; 2.ZhejiangMedical College,Hangzhou 310053,China)

This p ap e r reviewed recently p ub lished m ulti-res idue chrom a tog rap hic m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones in food.Afte r a b rief introduc tion on s te roid horm ones,an ove rview emp has ized on m ulti-res idue ana lytica lm e thods w ith de ta il exp lica tion,cove ring samp le extrac tion and p urifica tion as we ll as chrom a tog rap hic sep a ra tion and d iffe rent de tec tion m e thods,be ing in use for the de te rm ina tion of s te roid horm ones.Fina lly,the deve lopm ent trends of m ulti-res idue de tec tion m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones we re summ a rized.

s te roid horm ones;m ulti-res idue;ana lytica lm e thods

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0378-04

1 概述

性激素是一類由動物體性腺所產生或人工合成的低分子量、親脂性、具有生物活性的類固醇類物質,根據其生物活性和藥理作用,可以將其分為重要的兩類：性類固醇和皮質類固醇。前者又包括雌激素、孕激素和雄激素。另外目前還有很多人工合成的性激素,臨床應用較多的如己烯雌酚。

從20世紀50年代起,性激素這一大類物質就被用于動物的喂養,如今歐盟已經對其在動物喂養方面的使用進行了嚴格禁止。同時關于性激素對人體的危害也引起了公眾的廣泛關注,有報道稱,近年來婦女子宮瘤、乳腺癌等病變發病率的逐漸升高與動物源食品中的性激素殘留有關系[1]。各國政府相應出臺了一系列的政策和標準來控制性激素的濫用,在此基礎各種關于性激素的檢測方法也逐步發展起來。如 GB/T5009.108畜禽肉中已烯雌酚的測定、SN/T1744-2006進出口動物飼料中己烷雌酚、已烯雌酚、雙烯雌酚殘留量的檢驗方法 (氣相色譜串聯質譜法)、Sadao N[2]等采用 GC/MS(氣相色譜-質譜)同時測定了水中的六種性激素、崔曉亮[3]等利用超高效色譜/串聯質譜測定了牛奶中12種糖皮質激素含量等。

2009-03-24

虞淼(1981-),男,碩士,助理農藝師,研究方向：農藥質量分析、農藥殘留分析、農產品質量安全。