殼聚糖鑭配合物的制備、表征及其抑菌性能

馮小強,李小芳,楊 聲,＊,伏國慶,王廷璞,蘇中興

(1.天水師范學院生化學院,甘肅天水 741001; 2.天水市中醫(yī)醫(yī)院,甘肅天水 741001;3.蘭州大學化學化工學院,甘肅蘭州 730000)

殼聚糖鑭配合物的制備、表征及其抑菌性能

馮小強1,李小芳1,楊 聲1,＊,伏國慶2,王廷璞1,蘇中興3

(1.天水師范學院生化學院,甘肅天水 741001; 2.天水市中醫(yī)醫(yī)院,甘肅天水 741001;3.蘭州大學化學化工學院,甘肅蘭州 730000)

合成了不同配比的殼聚糖鑭配合物,運用 FT-I R、UV、TG-DTA和循環(huán)伏安法進行了表征。測試了殼聚糖及其鑭配合物對埃希氏大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能。結(jié)果表明,殼聚糖鑭配合物的抑菌性能較殼聚糖有明顯提高,抑菌性能隨鑭與殼聚糖配比的增大而增強。殼聚糖鑭配合物處理后的 E.coli和 St.aureus的細胞壁、膜被損壞,外部有內(nèi)容物溢出,表明殼聚糖鑭配合物首先作用于細菌細胞壁膜,進而進入菌體內(nèi)部而起到抑菌作用。

殼聚糖,殼聚糖鑭配合物,制備,表征,抑菌性能

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 相對分子量 14萬,DD＞95%,浙江金殼生物化學有限公司;La2O3純度 99.95%,上海化學試劑公司;硝酸、NH3·H2O、NaOH、無水乙醇、乙醚、醋酸 均為分析純;實驗用水 二次蒸餾水;大腸埃希氏菌 (E.coli,ATCC 35218),金黃色葡萄球菌(S t.aureus,ATCC 26113),牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,瓊脂培養(yǎng)基。

紫外可見分光光度計 UV-9200型,北京瑞利分析儀器公司;TG-DT A分析儀 Pyris Diamond Analyzer;Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 Perkin E lmere;LK98A微電極電化學分析系統(tǒng) 天津蘭力科,修飾玻碳電極為工作電極,飽和甘汞電極做參比電極(vs.SCE.),Pt柱為對電極;JEM-1230透射電子顯微鏡 Hitachi,Tokyo,Japan。

1.2 殼聚糖鑭配合物的制備

稱取0.5g CTS溶解于50mL 1%HAc溶液中。按殼聚糖 (糖單元)與 La(Ⅲ)摩爾比為 4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1加入不同質(zhì)量的 La(NO3)3攪拌,編號1～5。用 1%的氨水調(diào)節(jié) pH至 5.0,室溫下攪拌反應(yīng)12h。將其混合液濃縮后冷卻至室溫,加入到 200mL丙酮溶液中沉淀。依次用蒸餾水、無水乙醇、乙醚洗滌,得到殼聚糖鑭配合物。

1.3 殼聚糖鑭配合物抑菌活性的測定

1.3.1 菌懸液的制備 受試菌種(標準菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化 24h。將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成 OD610nm= 0.7的菌懸液備用。

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、固體瓊脂培養(yǎng)基的制備 參見文獻[11]。

1.3.3 樣品溶液的配制 殼聚糖及殼聚糖鑭配合物用 0.3%HCl溶解,分別配制 10mL 15mg/mL的樣品溶液。

1.3.4 抑菌性能測試 (OD) 受試菌種 (標準菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化 24h。活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成OD630nm=0.7的菌懸液備用。將 13.9mL的液體培養(yǎng)基與1mL的藥物溶液混合,加入 100μL菌懸液,使殼聚糖及其配合物的最終濃度為 1mg/mL,恒溫振蕩培養(yǎng)。測定不同時間內(nèi)的 OD610nm值,光密度越小,抑菌性能越強。恒溫培養(yǎng) 48h后采用菌落平板記數(shù)法測定殼聚糖的最小抑菌濃度 (M I C),使殼聚糖的最終濃度分別 為 0.05%、0.025%、0.0125%、0.00625%、0.00313%、0.00156%(w/v)。最小抑菌濃度定義為與對照相比,以肉眼觀察不到菌落對應(yīng)的殼聚糖與其配合物的濃度[12]。

1.4 殼聚糖鑭配合物的表征

1.4.1 紅外光譜(FT-I R) 采用 KBr壓片法測定殼聚糖及其鑭配合物的紅外吸收光譜,測量波長數(shù)為400～4000cm-1。

1.4.2 紫外光譜(UV) 以 0.3%HCl殼聚糖溶液為空白,于 200～600nm波長范圍內(nèi)測定殼聚糖與殼聚糖鑭配合物的紫外吸收光譜。

1.4.3 差熱-熱重分析 (TG-DTA) 以α-Al2O3為參比,升溫速率 10℃/min,對殼聚糖及殼聚糖鑭配合物進行熱力學分析。

1.4.4 殼聚糖鑭配合物的循環(huán)伏安行為 玻碳電極用三氧化二鋁拋光粉拋光處理后,依次用 1∶1的硝酸溶液、無水乙醇、去離子水超聲 5min,將電極置于紅外燈下烘烤至干,待電極冷卻后,用微型注射器取10mg/mL的殼聚糖鑭配合物溶液 10μL,均勻涂在電極表面,自然晾干,便得到殼聚糖鑭配合物化學修飾電極,在 1mol/L的 KNO3緩沖液中測定其循環(huán)伏安行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

對比圖 1中 a和 b可看出,殼聚糖中在 I R譜圖高波數(shù)區(qū) 3436cm-1處-OH與-NH2的締合伸縮振動吸收峰在配位后峰形變寬,說明殼聚糖中的-NH2、-OH可能參與了配位反應(yīng)。殼聚糖在 1649cm-1處有較強的酰胺吸收峰,配位后位移至 1635cm-1處, 1711cm-1處為殼聚糖中酰胺鍵中的-C=O吸收峰,在配合物中消失,證明殼聚糖中的酰胺鍵參與了配位;殼聚糖中 1590cm-1左右的-NH2伸縮振動吸收峰配位后消失,1383cm-1附近處出現(xiàn) C-H彎曲振動和C-N的伸縮振動疊加吸收在配合物中發(fā)生了微小位移并有所減弱,說明氨基參與了配位;殼聚糖中位于1155cm-1處仲羥基的 C-O伸縮振動吸收峰在配合物中消失,位于 1091.73cm-1處的伯羥基的 C-O伸縮振動吸收峰移至 1089.12cm-1處且峰形變寬, 1421.21cm-1的-OH收縮峰在配合物中幾乎消失,表明-OH參與了配位[1]。以上結(jié)果說明殼聚糖中的-OH與-NH2都參與了配位反應(yīng)。

圖 1 殼聚糖(a)及其鑭配合物(b)的紅外光譜

2.2 紫外光譜分析

由圖 2可知,殼聚糖在 257.00nm和 326.00nm處有 2個強吸收峰,且峰形較寬,而 CTS-La(Ⅲ)吸收在259.00nm和 331.50nm處,發(fā)生了較大的位移且吸收強度發(fā)生了變化,這可能是配合物中氮、氧的孤對電子發(fā)生 n→σ＊躍遷,導致電子光譜發(fā)生變化。由此可證明La(Ⅲ)與 CTS發(fā)生了配位反應(yīng),且 C-N鍵由于-NH2與La(Ⅲ)的結(jié)合,在一定程度上使該鍵有所削弱,從而可推斷-NH2是CTS分子中主要吸附部位。

圖2 殼聚糖及其鑭配合物的紫外光譜

2.3 差熱-熱重分析

由殼聚糖及殼聚糖 La(Ⅲ)配合物的 TG-DTA曲線(圖 3)可知,殼聚糖及殼聚糖 La(Ⅲ)配合物的失重都分為三個階段：第一階段,殼聚糖為20～150℃,殼聚糖La(Ⅲ)配合物為 20～180℃,在這一階段兩者分別失重 11.3%和 13.4%;第二階段,殼聚糖為 150～310℃,殼聚糖 La(Ⅲ)配合物為180～380℃,在這一階段殼聚糖和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物分別失重 56.5%和 29.8%;第三階段,殼聚糖為310～630℃,殼聚糖 La(Ⅲ)配合物為 380～560℃,在這一階段殼聚糖和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物分別失重28.8%和 32.0%。分析可知,殼聚糖 150℃以前和殼聚糖La(Ⅲ)配合物 180℃以前的失重都是由失水所致;殼聚糖 150～310℃和殼聚糖 La(Ⅲ)配合物在180～380℃出現(xiàn)的失重,是由于殼聚糖和殼聚糖La(Ⅲ)配合物的降解;第三階段的失重,可能是由于殼聚糖與鑭配位后,其分子內(nèi)的氫鍵結(jié)合被破壞,結(jié)晶度發(fā)生改變,熱穩(wěn)定性減小的原因。

圖 3 殼聚糖(a)及其鑭配合物(b)的差熱-熱重分析

2.4 殼聚糖鑭配合物修飾電極的循環(huán)伏安行為

圖 4為殼聚糖和殼聚糖鑭配合物修飾玻碳電極在 1mol/L KNO3緩沖液中掃速為 100mV/s時的循環(huán)伏安曲線?？梢钥闯?殼聚糖修飾電極在 KNO3緩沖液中無氧化-還原峰出現(xiàn),而殼聚糖鑭配合物修飾電極在約-0.245V處出現(xiàn)一還原峰,在 0.536V左右出現(xiàn)一氧化峰,說明非電活性的殼聚糖與鑭離子發(fā)生了配位,生成了具有電活性的殼聚糖鑭配合物。

圖4 殼聚糖鑭配合物的循環(huán)伏安曲線注：a.CTS-La(Ⅲ)修飾玻碳電極; b.殼聚糖修飾玻碳電極 KNO3緩沖液中。

2.5 抑菌性能研究

圖 5為殼聚糖及其鑭配合物分別作用于 E.coli和 S t.aureus在不同時間的 OD610nm曲線圖。E.coli和S t.aureus經(jīng)殼聚糖和殼聚糖鑭配合物作用后,對應(yīng)的光密度值均小于殼聚糖,說明殼聚糖在發(fā)生配位反應(yīng)以后抑菌性能有所增強。另外,隨著 La(Ⅲ)與殼聚糖配比的增加,其對 E.coli和 S t.aureus的抑制作用逐漸增強。表 1為殼聚糖及其鑭配合物對 E.coli和 S t.aureus的最小抑菌濃度,可以看出,隨著配合物中La(Ⅲ)濃度的增大,其抑菌性能增強,最小抑菌濃度依次降低,說明配合物的抑菌性能是殼聚糖與 La (Ⅲ)的協(xié)同作用。

圖 5 殼聚糖鑭配合物對 E.coli(a)和 St.aureus(b)的抑菌性能

研究認為[13],殼聚糖的抑菌作用與其氨基的質(zhì)子化有關(guān),在酸性條件下,殼聚糖分子鏈上的-NH2與 H+結(jié)合形成-NH+3正離子,與細菌表面的負電荷發(fā)生靜電作用,使細菌被絮凝,聚沉,生長繁殖也隨之減弱。另外,在酸性環(huán)境下,質(zhì)子化氨中的 H+可能與營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合,并能交換細胞表面的某些微生物生長所需要的陽離子如Mn2+、Ca2+、Mo2+等,從而影響細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,對機體產(chǎn)生不利的影響。CTS-La(Ⅲ)能顯示出較殼聚糖強的抑菌活性,是由于殼聚糖和La(Ⅲ)兩者抑菌活性的協(xié)同作用,殼聚糖與La(Ⅲ)配位后,所帶正電荷較殼聚糖增多,更易與細菌結(jié)合,故抑菌活性高于殼聚糖。

表 1 殼聚糖鑭配合物的最小抑菌濃度(%、w/v)

2.6 殼聚糖鑭配合物處理前后大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的形貌變化

大腸桿菌(圖6a、圖6b)：對照組(圖6a)：細菌切面多呈桿狀,細胞壁、細胞膜完整,胞質(zhì)均勻。藥物組(圖6b)：細菌形態(tài)呈現(xiàn)球形體,菌體細胞壁部分或全部脫落消失,細菌輪廓模糊,外觀呈毛刺狀,結(jié)構(gòu)不清且發(fā)生不同程度的凹陷變形,甚至穿孔和破碎;胞漿內(nèi)容物稀疏,空隙明顯擴大,細胞外有溶出物出現(xiàn)。細菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失或分布異常。

圖 6 殼聚糖鑭配合物處理前(a、c)后 (b、d)E.coli和 St.aureus的形貌

金黃色葡萄球菌(圖 6c、圖 6d)：對照組(圖 6c)：細菌切面多呈葡萄球狀,細胞壁、細胞膜完整,胞質(zhì)均勻。藥物組(圖6d)：細菌形態(tài)發(fā)生變化,細菌內(nèi)部分布異常,菌體輪廓模糊,外圍有液體溢出的痕跡,并有空腔出現(xiàn)。

3 結(jié)論

3.1 合成了幾種不同配比的 CTS-La(Ⅲ)配合物。FT-I R、UV、TG-DT A、循環(huán)伏安分析結(jié)果表明,殼聚糖與La(Ⅲ)之間發(fā)生了配位反應(yīng),形成了配合物CTS-La(Ⅲ)。

3.2 配合物 CTS-La(Ⅲ)的抑菌性明顯強于殼聚糖,其抑菌性能與La(Ⅲ)與殼聚糖的摩爾配比有關(guān),隨著配合物中La(Ⅲ)含量的增加,最小抑菌濃度減小,抑菌性能逐漸增強。

3.3 CTS-La(Ⅲ)配合物處理后的 E.coli和 S t.aureus的細胞壁、膜被損壞,外部有內(nèi)容物溢出,表明 CTSLa(Ⅲ)首先作用于細菌細胞壁膜,進而進入內(nèi)部。

[1]XiaohuiWang,Yumin Du,Lihong Fan,et al.Chitosan-metal complexes as antimicrobial agent：synthesis,characterization and structure activity study[J].PolymerBulletin,2005,55：105-113.

[2]孫昌梅,曲榮君,王春華,等 .基于殼聚糖及其衍生物的金屬離子吸附劑的研究進展[J].離子交換與吸附,2004,20(2)：184-192.

[3]相波,劉亞菲,李義久,等 .殼聚糖及其衍生物對重金屬吸附性能的研究[J].工業(yè)水處理,2004,24(5)：10-14.

[4]曹佐英,賴聲禮,曹珍年 .微波輻射下殼聚糖 Zn配合物的合成[J].現(xiàn)代化工,1999,19(11)：24-27.

[5]況偉 .低聚水溶性殼聚糖與鋅的絡(luò)合 [J].食品與機械, 2006,22(1)：15-17.

[6]劉振南 .殼聚糖對重金屬離子吸附的研究[J].廣西化工, 1996,25(2)：9-12.

[7]Park J H,Cha B J,Lee Y N.Antibacterial activity of chitosan acetateon food-borne enter opathogenic bacteria[J].Food Science and Biotechnology,2003,12(1)：100-103.

[8]Jeon YJ,Park PJ,Kim SK.Ant imicrobialeffectof chitooligosaccharides produced by bioreactor[J].Carbohydrate Polymers,2001,44：71-76.

[9]Liu XF,Guan YL,Yang DZ,et al.Antibacterial action of chitosan and carboxy methylated chitosan[J].Appl Polym Sci, 2000,79(7)：1324-1335.

[10]Issam S T,AdeleM G,Adele C P,et al.Chitosan polyer as bioactive coating and film againstAspergillus nigercontamination [J].Journal of Food Science,2005,70(2)：100-104.

[11]沈萍,等 .微生物學實驗[M].高等教育出版社,2003：53.

[12]Speciale A,Musumeci R,Blandino MG,et al.Int J Antimicrob Ag[J],2002,19：111.

[13]楊聲,馮小強,王廷璞,等 .殼聚糖對大腸桿菌的抑制作用規(guī)律及抗菌機理初探[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19：39-43.

Synthesis,characterization and antibacterial activity of chitosan-La(Ⅲ)complexes

FENG Xiao-qiang1,L I Xiao-fang1,YANG Sheng1,＊,FU Guo-qing2,WANG T ing-pu1,SU Zhong-xing3
(1.College ofBiology and Chemistry,TianshuiNormalUniverity,Tianshui 741001,China; 2.Tianshui Traditional ChineseMedical Hospital,Tianshui 741001,China; 3.Chemistry and Chemical Engineering College,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Chitosan-La(Ⅲ)comp lexes w ith d iffe rent ra tios we re synthes ized.The s truc tures of these comp lexes we re cha rac te rized by FT-IR,UV and TG-DTA.M oreove r,the antibac te ria l ac tivity of chitosan and its che lae comp lexes aga ins t E.coli and S t.aureus we re inves tiga ted in vitro.The results ind ica ted tha t the antibac te ria l ac tivity of chitosan che la te comp lexes was m a rked ly imp roved comp a red w ith chitosan,and which was re la ted to the ra tio of chitosan to La(Ⅲ).The ce ll wa ll and m em b rane of E.coli and S t.aureus we re des troyed afte r trea ted by chitosan-La(Ⅲ)comp lexes.

chitosan;chitosan-La(Ⅲ)comp lexes;synthes ize;cha rac te riza tion;antibac te ria l ac tivity

TS201.2

A

1002-0306(2010)02-0304-04

殼聚糖分子中含有羥基 (-OH)和游離的氨基(-NH2),其分子結(jié)構(gòu)中每個基本單元都連有一個伯氨基,氮原子上的孤對電子可投入到金屬離子等的空軌道中,形成配位鍵結(jié)合,因此它可以與 Fe2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+等配位,有效地捕集或吸附溶液中的金屬離子[1-4]。Wang等發(fā)現(xiàn)殼聚糖金屬離子配合物的抑菌活性優(yōu)于殼聚糖[5]。殼聚糖硒作為補硒劑,毒性較小,硒化殼聚糖對癌細胞具有明顯的抑制作用[6]。目前,殼聚糖及其降解產(chǎn)物在抗菌、抑菌方面已被應(yīng)用于各個領(lǐng)域中,其中有關(guān)殼聚糖及其衍生物抗菌性能的報道較多[7-9],認為殼聚糖不僅具有天然抗菌性能,而且抗菌譜廣。殼聚糖能有效地抑制細菌和真菌的生長和繁殖,與一般抑制劑相比,它具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高等優(yōu)點[10]。稀土元素具有許多特殊的生物活性和較好的抗菌能力,將其與殼聚糖配位將有望提高殼聚糖的抑菌性能和生物活性。論文合成了幾種不同配比的殼聚糖鑭配合物,運用 FT-I R、UV、TG-DTA和循環(huán)伏安法對配合物進行了表征。測試了殼聚糖及其鑭配合物 (CTSLa(Ⅲ))對大腸埃希氏菌 (E.coli)和金黃色葡萄球菌(S t.aureus)的抑菌性能。結(jié)果表明,殼聚糖鑭配合物的抑菌性能較殼聚糖有所提高,抑菌性能與其配比有關(guān)。該研究將拓展殼聚糖作為抑菌材料的應(yīng)用前景,有望開發(fā)一種天然綠色稀土生物農(nóng)藥。

2009-03-17 ＊通訊聯(lián)系人

馮小強(1980-),男,講師,研究方向：天然高分子生物活性研究。

天水師范學院院立項目;物理無機化學重點學科資助項目。