華根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究

王 楠,王 棟,徐 巖,周藝博

(江南大學生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

華根霉脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究

王 楠,王 棟,徐 巖＊,周藝博

(江南大學生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

研究了華根霉菌絲結合脂肪酶(RCL)非水相直接酯化合成乙酸香茅酯的反應條件。在醇酸比為 1.2∶1,反應溫度 40℃時得到較高的轉化率。但由于底物乙酸較強的抑制性,使得高底物濃度下 RCL催化能力受限。通過采用分批流加的方法使在底物濃度 0.2mol/L時轉化率提高至 94%。與 10種商品化脂肪酶進行了比較,發現在相同條件下RCL表現出較高的轉化效率。產物乙酸香茅酯的色澤好,氣味純正。

華根霉,菌絲結合脂肪酶,乙酸香茅酯,非水相體系

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香茅醇、乙酸香茅酯的標準品 色譜純,均購于Sigma公司;Lipozyme IM、南極假絲酵母 Candida antarctic脂肪酶 (CAL,即 N ovozym435) 購自 Novo Nordisk公司;玫瑰假絲酵母 Candida rugosa脂肪酶(CRL)、豬胰 Porcine pancreas脂肪酶 (PPL) 購自Sigma公司;熒光假單胞菌 Pseudom onas fluorescens脂肪酶 (AK)、青霉 Penicillium cam em berti脂肪酶 (G)、洋蔥假單胞菌 Pseudom onas cepacia脂肪酶 (PS)、固定與硅藻土的洋蔥假單胞菌脂肪酶 (PS-D)、爪哇曲霉 Aspergillus javanicus脂肪酶 (F-AP15) 購自Amano Phar maceutical公司;華根霉 Rhizopus chinensis CCTCC M201021菌絲結合脂肪酶(RCL)的制備見文獻[8];其他試劑 均為分析純。

1.2 脂肪酶合成活性的測定

分別取濃度為 1.2mol/L的辛酸和乙醇的庚烷溶液 0.5mL到 5mL離心管中,混合均勻后加入 10mg干菌體,在 40℃空氣振蕩器中反應 30min,反應結束后立即離心去除菌體,然后從上層清液中吸取 400μL反應液并加入 100μL內標 (己醇),氣相檢測生成的辛酸乙酯。氣相柱為 PEG20000,檢測器為 F ID,采用程序升溫,起始溫度 90℃維持 5min,以 10℃/min速率升溫 11min,最終溫度 200℃,保留時間 5min。在此條件下,1min生成 1μmol的辛酸乙酯所需的酶量定義為 1個合成酶活力單位。

1.3 水活度的控制

初始水活度平衡方法按徐巖等人的報道[6]。有機溶劑(包括反應的酸和醇)和 RCL均在 25℃密閉的容器內用飽和鹽溶液平衡 3d。所采用的鹽為LiCl (aw=0.113)、MgCl2(aw=0.30)、Mg(NO3)2(aw= 0.529)、NaNO3(aw=0.66)、NaCl(aw=0.75)和 K2SO4(aw=0.97)。

1.4 非水相酶促合成乙酸香茅酯反應

取 0.05mol/L香茅醇和等摩爾量的乙酸,置于磨口錐形瓶內,加入 10mL庚烷和脂肪酶。密閉后,置于恒溫空氣搖床上 200r/min反應。

定時從反應液中取 0.2mL,離心 (8000r/min 10min)取上清 0.1mL加入等體積 0.05mol/L正己醇作為內標。

1.5 乙酸香茅酯的檢測

產物酯分析采用的氣相色譜條件為：Agilent 6820氣相色譜儀,采用 PEG 20M(AC20)毛細色譜柱(30m×0.22mm),載氣為 N2;程序升溫,100℃保持1min,升溫速率 10℃/min至 200℃保持 3min。

乙酸香茅酯的轉化率 C(%)=測得的乙酸香茅酯含量/完全酯化的乙酸香茅酯含量 ×100%

1.6 紅外光譜分析

用 FT-I R SPECTROMETER紅外光譜儀鑒定產品乙酸香茅酯的結構,制樣方法采用液膜法。在400～4000cm-1范圍內掃描。

1.7 產品品質鑒定

相對密度的檢測方法：按照QB 796“香料統一檢查方法——比重測定”;酸度的檢測方法：按照QB 806“香料統一檢查方法——酸值測定”;折光指數的檢測方法：按照QB 798“香料統一檢查方法——折光指數測定”。

2 結果與討論

2.1 酶加量對華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

首先考察了酶加量對催化合成乙酸香茅酯的影響。通常在一定范圍內酶濃度越大,酶與底物接觸的幾率越大,催化反應速度越快。如圖 1所示,隨著加酶量增加,從 30U/mL到 120U/mL,乙酸香茅酯的轉化率幾乎呈線性增長,由 43%增加至 80.1%。這是因為當底物濃度大于酶量時,隨著酶量的增加,底物與酶形成酶-底物復合物量也逐漸增加,這種過渡態可迅速轉化為產物。但隨著酶加入量繼續增加,轉化率趨于平緩,無法進一步得到有效的提高?？紤]產率和經濟效益兩方面因素,選定最適酶加量為120U/mL。

圖 1 酶加量對 RCL合成乙酸香茅酯的影響

2.2 水活度對華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

在非水相催化研究中,一般認為初始水活度也是影響脂肪酶催化的一個重要因素。只有達到最佳水含量時,蛋白質結構的動力學剛性和熱力學穩定性之間才能達到最佳平衡點[9]。為此考察了不同初始水活度對 RCL合成乙酸香茅酯的影響,結果如圖2所示。

圖 2 初始水活度對RCL合成乙酸香茅酯的影響

從圖 2中可以看出,初始水活度對催化效果影響不是特別顯著,初始水活度范圍在 0.01～0.66之間時雖然轉化率呈下降趨勢,但 RCL均表現了較高的催化效率,從中可以看出,RCL可以耐受較為寬泛的水活度范圍。Gandolfi等人也報道了菌絲結合脂肪酶在酯化反應中對水的存在表現的不是特別敏感[10]。但當初始水活度超過臨界值時,轉化率有較為明顯的下降。這可能是由于水的過量存在有利于全細胞內水解酶催化從而影響反應平衡。

2.3 醇酸比對華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

通常優化底物摩爾比對轉化率的提高是一個有效的策略[11]。實驗考察了不同底物摩爾比對RCL催化合成乙酸香茅酯的影響,反應體系固定乙酸的量,將其和香茅醇按照一定摩爾比混合后加入反應體系中,結果如圖 3所示。

圖 3 不同醇酸比對RCL合成乙酸香茅酯的影響

開始時,隨著醇酸摩爾比的加大,乙酸香茅酯的轉化率明顯增大。在醇酸比升高至 1.2∶1時,轉化率由之前的 80.1%提高至 99.5%。其原因主要是酯化反應是可逆反應,過量香茅醇的存在有利于推動反應平衡向著酯合成方向移動,從而提高乙酸香茅酯的產率。但隨著醇酸摩爾比的進一步增加,轉化率及反應速率呈現下降趨勢,原因可能是醇分子通過其疏水性側鏈與脂肪酶活性中心周圍的非極性氨基酸相互作用,引起酶構象的局部改變,不利于其與酸分子結合。所以綜合考慮我們采用 1.2∶1作為最佳醇酸比。

2.4 分批添加底物酸對較高底物濃度下合成乙酸香茅酯的影響

為了進一步考察 RCL工業化應用前景,使下一階段的提取分離更為有效。在一定的菌體量條件下,考察了增加底物濃度對酯化反應的研究。當反應體系中乙酸含量較高時,作為合成反應的底物乙酸的極性較強(log P=0.5),在底物濃度為 0.2mol/L時轉化率大幅降低,只有 24%。為降低高濃度乙酸對 RCL的毒害作用。實驗采用分批流加乙酸的方式完成酯化反應,在反應第一步轉化率接近平衡時第二次添加底物乙酸,使得反應過程中乙酸濃度一直保持在較低的范圍內,避免在反應過程中引起酶的失活。從圖 4中可以看出,通過采用批次添加底物法使得在初速度較快,考慮原因是由于醇酸比高引起。最終轉化率可達到 93.7%,在高底物濃度下有效提高了轉化率。

圖 4 分批次添加乙酸對 RCL合成乙酸香茅酯的影響

2.5 反應批次對華根霉脂肪酶合成乙酸香茅酯的影響

按照上述的優化條件,考察了 RCL催化合成乙酸香茅酯的重復使用情況。在第二批反應時酶活受到一定影響,接下來 5批次反應后乙酸香茅酯的產率仍可達 80%左右,說明多次重復使用后,RCL仍能保持較好的活性,整個反應體系在上述的優化條件下有較好的操作穩定性。

圖5 RCL合成乙酸香茅酯的批次穩定性

2.6 華根霉脂肪酶與商品化脂肪酶合成乙酸香茅酯的比較

對具有相同酯合成酶活力單位的商品化脂肪酶和 RCL在相同的反應體系下對乙酸香茅酯的轉化效果進行了研究,結果如表 1所示。

表 1 不同脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的效果比較

從表 1中可以看出：脂肪酶的來源不同,其催化活性也不同。其中Novozym 435的轉化效果最佳,最終轉化率可以達到 95.1%,其次是 RCL,其轉化效果與Novozym 435相差不大,轉化率接近94%?？紤]到RCL作為菌絲結合脂肪酶省去了復雜的純酶提取與固定化等工藝,除了具有較高的轉化率之外,在成本價格上與商品化脂肪酶相比具有一定的優勢,所以RCL有利于酶法生產乙酸香茅酯工業化的應用。

2.7 產物表征分析與品質鑒定

2.7.1 產物紅外光譜鑒定 將經過減壓蒸餾分離的乙酸香茅酯與標樣進行紅外光譜的鑒定。結果如圖 6所示?？梢?樣品的紅外光譜圖與美國 Sigma-Fluka公司的色譜醇標準品基本一致?？梢宰C明產物為乙酸香茅酯。

圖 6 乙酸香茅酯產品與標準樣品紅外圖譜分析注：1-標準樣品;2-產物乙酸香茅酯。

2.7.2 產物品質鑒定 把產物乙酸香茅酯按照國標GB 14156-93“食品添加劑—乙酸香茅酯”的內容對其質量進行分析結果見表 2。

表 2 產品品質與乙酸香茅酯國標的對比結果

從表 2中所示,產物乙酸香茅酯色澤好、氣味純正,且各項指標均符合國家標準。

3 結論

本研究系統地考察了華根霉全細胞脂肪酶(RCL)有機相催化合成乙酸香茅酯的過程,研究結果表明,在有機相中 RCL對合成乙酸香茅酯有較高的催化效率。由于乙酸較強的極性會抑制 RCL的催化效率,通過采用分步添加底物乙酸的方法,可以在較高的底物濃度下達到較好的催化效果,而且 RCL本身具有成本優勢,與其他商品化脂肪酶相比,在生物法合成乙酸香茅酯的工業生產中具有良好的應用前景。

[1]Melo L,Pastore G M,Macedo GA.Optimized synthesis of citronellyl flavour esters using free and immobilized lipase from Rhizopus sp[J].ProcessBiochem,2005,40(10)：3181-3185.

[2]Yadav GD,Lathi PS.Synthesisof citronellol laurate in organic media catalyzed by immobilized lipases：kinetic studies[J].Jmol CatalB：Enzym,2004,27(2-3)：113-119.

[3]Lozano P,Piamtongkam R,Kohns K,et al.Ionic liquids improve citronellyl estersynthesis catalyzed by immobilized Candida antarcticalipase B in solvent-free media[J].Green Chemistry,2007,9(7)：780-784.

[4]Garcia T,Sanchez N,MartinezM,et al.Enzymatic synthesis of fatty esters Part I.Kinetic approach[J].Enzyme Microb Technol,1999,25(7)：584-590.

[5]Fonteyn F,Blecker C,Lognay G,et al.Optimization of lipase -catalyzed synthesis of citronellyl acetate in solvent-freemedium [J].BiotechnolLett,1994,16(7)：693-696.

[6]Xu Y,Wang D,Mu X,et al.Biosynthesis of ethyl esters of short-chain fatty acids using whole-cell lipase fromRhizopus chinesisCCTCC M201021 in non-aqueous phase[J].Journal ofmolecular CatalysisB,Enzymatic,2002,18(1-3)：29-37.

[7]謝紅想 .有機相中芳香酯合成用脂肪酶產生菌的篩選及其應用[D].無錫：無錫輕工大學碩士論文,1998.

[8]Wang D,Xu Y,Teng Y.Synthetic activity enhancement of membrane-bound lipase fromRhizopus chinensisby pretreatment with isooctane[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2007, 30(3)：147-155.

[9]孫志浩 .生物催化工藝學[M].北京：化學工業出版社現代生物技術與醫藥科技出版中心,2005.

[10]Gandolfi R,Converti A,Pirozzi D,et al.Efficient and selective microbial esterification with dry mycelium ofRhizopus oryzae[J].J Biotechnol,2001,92(1)：21-26.

[11]Gillies B YHaADW.Production of Flavor Esters by Immobilized Lipase J[J].BiotechnologyLetters,1987,9(10)：709 -714.

Biosynthesis of citronellyl acetate using mycelium-bound lipase fromRhizopus chinesis

WANG Nan,WANG Dong,XU Yan＊,ZHOU Y i-bo
(School ofBiotechnology,KeyLaboratory of IndustrialBiotechnology of theMinistry of Education,Southern Yangtze University,Wuxi 214122,China)

Seve ra l reac tion p a ram e te rs in the m yce lium-bound lip ase from Rhizop us chinens is(RCL)ca ta lyzes es te rifica tion we re inves tiga ted,high conve rs ion was ob ta ined by a lcohol/ac idm ola r rad io of1.2∶1a t40℃.But us ing highe r subs tra te concentra tions couldn’t achieve re la tive ly highe r conve rs ion.To imp rove the p roduc tion of the c itrone llyl ace ta te,an app roach by p ortion-w ise add ition of subs tra te was es tab lished.The conve rs ion of the p roduc t es te rwas inc reased to94%w ith highe r subs tra te leve l of0.2m ol/L.Comp a red w ith10comm e rc ia l l ip ases, RCL was p roved to be m os t suitab le for the synthes is of c itrone llyl ace ta te econom ica lly in non-aqueous p hase. The p roduc t of c itrone llyl ace ta te shows good color and p ure odor.

Rhizop us chinens is;m yce lium-bound lip ase;c itrone llyl ace ta te;non-aqueous p hase

TS202.3

B

1002-0306(2010)02-0307-04

乙酸香茅酯屬于萜烯短鏈脂肪酸酯類化合物,天然存在于玫瑰油及香茅油中,具有清甜的檸檬果香及似玫瑰、薰衣草的香氣。由于香氣特征明顯受到廣大調香師的青睞,用于調配玫瑰、梔子、鈴蘭、香石竹、薰衣草和康乃馨等香型香精,是重要的香料成分并已廣泛應用于飲食及化妝品等領域[1]。目前乙酸香茅酯的生產方式主要是化學合成的方法,還有極少量是從天然植物中分離提取。盡管化學合成的方法目前還比較經濟,但是人們對天然產物和高品質產品興趣逐漸增強,而從植物中提取又無法滿足日益增長的需求,人們轉向用生物技術的方法生產。與化學法相比,酶促法催化合成的乙酸香茅酯被認為是高質量的天然產品,加上酶法反應條件溫和、轉化率高等優點而吸引了許多人的研究,被看成是很有希望的工業化途徑[2]。目前人們對脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的研究較少,在國外研究中主要使用一些商品化脂肪酶[3-5]。由于商品化脂肪酶的價格普遍較高,如果在工業生產中使用,生產成本將會大幅度提高。因此開發具有較強催化能力且價格低廉的脂肪酶非常有吸引力。本實驗室前期研究發現從酒曲中篩選得到的華根霉 Rhizopus chinensisCCTCC M201021在非水相中具有酯合成的能力[6-7],進一步研究發現該菌株所產的脂肪酶為膜結合脂肪酶,可以進一步穩定酶的構象[8]。通過凍干菌絲體可以直接投入使用,省去了提取、純化和固定化等工序從而節省了催化劑的生產成本。本研究以提高產物得率為目標,對華根霉菌絲結合脂肪酶非水相合成乙酸香茅酯的特性進行研究。

2009-06-03 ＊通訊聯系人

王楠 (1985-),女,碩士研究生,研究方向：非水相酶促催化。

國家高科技發展計劃 (863)項目 (2007AA100401);江蘇省自然科學基金 (BK2007020);生物反應器工程國家重點實驗室開放課題。