牛奶中抗生素殘留檢測試劑盒的研制及應用

謝 莉,程 華,董 超,李志平,朱俊平,閆靜輝,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家莊 050081; 2.河北省獸藥監察所,河北石家莊 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050071)

牛奶中抗生素殘留檢測試劑盒的研制及應用

謝 莉1,程 華1,董 超1,李志平2,朱俊平3,閆靜輝1,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家莊 050081; 2.河北省獸藥監察所,河北石家莊 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050071)

對嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的生成、營養基質、各成分添加比例等條件進行了研究,研制出檢測牛奶中抗生素殘留的 96孔板試劑盒。此試劑盒對牛奶中青霉素 G的檢測極限為 3ng/mL,阿莫西林的檢測極限為 4ng/mL,頭孢匹林的檢測極限為8ng/mL。同一批奶樣檢測結果證明,此試劑盒與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司同類試劑盒產品質量相當,靈敏度高于國標 TTC法,適于推廣應用。

抗生素殘留,檢測,牛奶,嗜熱脂肪芽孢桿菌

1 材料與方法

1.1 材料與設備

120份新鮮原奶樣品 采自石家莊某乳制品廠;無抗奶 光明乳業股份有限公司;嗜熱脂肪芽孢桿菌 河北省生物研究所保藏;青霉素 G、阿莫西林、頭孢匹林、磺胺嘧啶、頭孢氨芐、四環素、土霉素、溴甲酚紫 購于 SIG MA公司;ECL IPSE 50試劑盒 西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司產品;種子培養液 胰蛋白胨 1%、酵母粉 0.5%、氯化鈉 0.5%,pH7.2;芽孢生成培養基 胰蛋白胨 0.3%、酵母粉 0.4%、氯化鎂0.2%、氯化鈣 0.1%、硫酸錳 10mg/L、瓊脂 1.5%, pH7.2;營養培養基 胰蛋白胨 1%、牛肉膏 0.5%、葡萄糖 1%、瓊脂 0.8%,pH7.2。

S W-CJ-2F凈化臺 蘇州凈化設備有限公司; DNP-9052恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢的生成 從斜面上挑取一環實驗菌接種到盛有 50mL種子培養液的三角瓶中,于 55℃, 120r/min搖床培養,達到對數生長期后吸取 1mL菌液到已鋪好的芽孢生成培養基平板中,玻璃棒涂勻,將其置于 60℃培養箱中培養,定期涂片顯微鏡檢查芽孢生成情況[5-6]。

1.2.2 芽孢的富集 用滅菌的生理鹽水洗下平板上的芽孢,5000r/min離心 10min,傾去上清液,添加生理鹽水洗滌兩次,最后混勻制成芽孢懸液,煮沸20min,殺死營養體,4℃保存備用。

1.2.3 抗生素檢測試劑盒的制備方法 往融化的營養培養基中,加入溴甲酚紫指示劑和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸液,充分搖勻后用排槍吸取混合液加到96孔板中,待其冷卻后用不干膠封口。4℃保存備用。

1.2.4 制備條件的優化

1.2.4.1 營養培養基 pH及瓊脂濃度的確定 調節營養培養基 pH為 6.5、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4等不同值,進行檢測實驗,待確定合適的 pH后,改變瓊脂濃度為 0.5%、0.8%、1.0%、1.2%,檢測實驗選擇最佳培養基配方。

1.2.4.2 指示劑濃度的確定 用無水乙醇配制溴甲酚紫溶液濃度為 15mg/mL,再分別吸取 10、20、40、60、80μL添加到 100mL營養培養基中,進行檢測實驗,確定指示劑的最佳加入量。

1.2.4.3 芽孢濃度的確定 添加不同比例的芽孢懸液到營養培養基中,進行檢測實驗,以確定體系中需要加入的芽孢量。

1.2.5 試劑盒均一度檢測 取出抗生素檢測試劑盒,其中 48孔加入 50μL無抗奶作為陰性對照,48孔加入 50μL含 10mg/mL青霉素的牛奶作為陽性對照,微孔密封好后置于 65℃培養箱培養一定時間后,從微孔側面觀察,根據顏色變化進行結果判斷。

1.2.6 檢測結果的判斷依據 黃色到黃綠色為陰性結果范圍;藍紫色為陽性結果范圍;當檢測結果顏色界于陰性、陽性之間時,如淡藍色為可疑結果,是本試劑盒的檢測極限。

1.2.7 不同抗生素的檢測靈敏度分析 選用不同的抗生素,用無抗奶配制成不同濃度,取 50μL用試劑盒進行檢測。實驗結果與規定的最大殘留限制(MRL)進行比對(濃度配制根據不同抗生素的MRL規定,在范圍上下采用 1ng或 10ng級別遞增或遞減)。

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1.2.8 穩定性分析 制備好的試劑盒密封好后置于4℃保存 0、30、60、90、180d后,分別記錄其陰性檢測時間。

1.2.9 試劑盒的評價 從石家莊某乳制品廠采集新鮮原奶樣品 120份,采用實驗研制的試劑盒進行檢測,并與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生產的ECL IPSE 50試劑盒及國標 TTC法進行比較。

2 結果與分析

2.1 芽孢懸浮液的制備

嗜熱脂肪芽孢桿菌在種子培養液中培養 14～16h后達到對數生長期,將種子液涂布到芽孢生成培養基平板中,60℃培養 6h后,開始出現芽孢,培養 24h后顯微鏡觀察芽孢生成率達到 90%以上。用生理鹽水洗下芽孢,煮沸殺死營養體,通過稀釋平板計數法,調整懸液的體積,使芽孢數量達到109個 /mL。

圖1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢

2.2 營養培養基 pH及瓊脂濃度的確定

溴甲酚紫指示劑的變色范圍是 pH5.2～6.8,考慮在營養培養基的 pH接近指示劑的檢測極限時,芽孢萌發產酸可使指示劑顏色更好地發生變化,但實驗結果發現,pH變化對反應變色時間沒有明顯的影響。在營養瓊脂培養基滅菌前 pH為 6.5、6.8和 6.9時,制備成孔板后,微孔顏色為紫紅色;pH為 7.0、7.2和 7.4時微孔中培養基呈現藍紫色,考慮到滅菌過程中 pH的降低,以及嗜熱脂肪芽孢桿菌生長所需的pH,故選擇營養培養基 pH為 7.2。

實驗中還發現,營養培養基中瓊脂濃度越低,微孔檢測反應時間越短,但瓊脂濃度過低,基質過于柔軟,不利于保存與運輸,故選擇營養培養基瓊脂濃度為0.8%。

2.3 指示劑濃度的確定

實驗結果表明,指示劑的添加量為每 100mL培養基添加 10、20μL時,檢測微孔內的瓊脂培養基顏色過淺,不利于判斷;而添加量過多時則可能會對嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長造成影響,因此,最后確定每100mL培養基中加入指示劑 40μL,這時微孔顯色效果較好,均呈現藍紫色。

2.4 芽孢濃度的確定

實驗結果表明,嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢濃度過低,培養后產酸太少不能使指示劑發生顏色變化,而加入量過高后,容易產生假陰性結果。經多次實驗,確定芽孢懸液加入量為1%。

2.5 試劑盒均一度檢測

經 65℃培養 2.5h后,加入無抗奶的 48孔均變為純正的黃色,而加入有抗奶的 48孔仍為藍紫色。所有微孔顏色均勻,無漏孔現象。

2.6 常用藥物檢測限

使用該試劑盒對牛奶中常見的 6種抗生素殘留進行檢測,依據顏色變化進行判斷,結果見表 1。由表 1中可以看出,嗜熱脂肪芽孢桿菌 96孔板法能檢測出牛奶中多種抗生素,并且低于規定的最大殘留檢測限[7-8]。

表 1 96孔板法檢測 6種藥物殘留的結果

2.7 穩定性分析

由于芽孢有一個衰減的過程,故芽孢數量會有一定的減少,陰性檢測時間會隨著時間的延長有所變化。表 2為試劑盒存放不同時間陰性檢測結果。從中可以看出,陰性檢測時間變化較小,試劑盒在4℃保存 6個月后,檢測時間只延長了 10min,說明本試劑盒能夠保證實驗的穩定性。同時為了確保實驗的準確性,每次實驗需作陰性對照,以此來確定加熱培養所需的最佳時間。

表2 試劑盒穩定性測試

2.8 試劑盒的應用

從表 3可以看出,檢測同一批樣品 (n=120),用本試劑盒與西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生產的ECL IPSE 50試劑盒的檢測結果完全相同,兩者陽性檢出率都為 3.33%,高出國標 TTC法陽性檢出率1.67個百分點,說明本試劑盒靈敏度達到國外同類試劑盒檢測水平,效果好于常用的 TTC法。

表3 試劑盒的應用結果

3 結論

本實驗以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌,溴甲酚紫為指示劑,輔以合適的營養基質,研制了檢測抗生素殘留的試劑盒。為了提高檢測方法的靈敏度和穩定性,在芽孢和指示劑的含量、營養基質的配方等方面進行了大量的實驗。研制的試劑盒對牛奶中常見的β-內酰氨類、磺胺類、四環素類等抗生素藥物具有較好的檢測靈敏度,在 6個月的保存期內,具有較好的檢測穩定性。采用該試劑盒與西班牙 ZEUINMUNOTEC公司生產的 ECL IPSE 50試劑盒檢測同一批樣品、兩者檢測結果完全相同,說明該試劑盒與國外同類試劑盒質量相當,但我們研制的試劑盒有很大的價格優勢,利于大規模推廣應用。同時與 TTC法相比,該試劑盒操作簡便靈活,使用的 96微孔板可以獨立分拆,奶樣不用預處理,只需要一步操作即可完成,且結果直觀易懂,省去了 TTC法復雜的前處理工作。因此本試劑盒可以應用于牛奶中抗生素殘留的檢測,適合于牧場、乳品廠及食品衛生檢測部門的使用。

[1]鄧斌,鄧春來,張曦 .牛奶中抗生素殘留及其檢測方法研究進展[J].飼料工業,2003,24(4)：24-27.

[2]陳懷宇,黃周英,林育騰 .牛乳中抗生素的殘留與危害現狀[J].泉州師范學院學報,2004,22(6)：102-106.

[3]NEAL C E,CALBERT H E.The Application of the 2,3,5-TriphenylterfrAzolium Chloride Test for Inhibitory Substances in Milk[J].Dairy Science,1955,38：597.

[4]紀淑娟,浩淼,李東華 .TTC法檢測牛乳中抗生素快速檢測試紙的制作[J].食品工業科技,2009,9(2)：85322-327.

[5]P J THOMPSON,O A THAMES.Sporulation ofBacillus stearother m ophilus[J].Applied Microbiology,1967,15(5)：975-979.

[6]王天云,陳振風,王福源 .一種促使乳酸芽孢桿菌大量生成芽孢的方法[J].工業微生物,2001,31(3)：13-18.

[7]JACQUES N,HARRY V,IISE S,et al.A microbiological assay system for assess ment of raw milk exceeding EU maximum residue levels[J].IntDairy J,1999,9(2)：85-90.

[8]CODEX A.Residues of veterinary drugs in foods[S].Food and Agiculture Organization of the United Nations,FAO,Rome. 1993,3,Second Edition.

Preparation and application of kit for detection of antibiotic residue in milk

XIE L i1,CHENG Hua1,DONG Chao1,L I Zhi-ping2,ZHU Jun-ping3,YAN Jing-hui1,＊
(1.Hebei Institute ofBiology,Shijiazhuang 050081,China; 2.Hebei Institute ofVeterinaryMedision Superusion,Shijiazhuang 050051,China; 3.Hebei Sanyuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050071,China)

In orde r to ques t for a kind of s imp le m e thod to check whe the rm ilk conta ins antib iotics in a concentra tion exceed ing the M ax im um Res idue L im its(MLR),thecond ition of thede tec tion such assp orula tion Bac illus S tea rothe rm op hillus and nutrient and add ing p rop ortion of each comp onent we re s tud ied.The es tab lished kit tha t each we ll of96p la te conta ined g row th m ed ium sp read w ith Bac illus s tea rothe rm op hilus sp ores,which assure to96 ind ividua l tes ts we re checked a t the sam e t im e.The de tec tion l im its of the kit to p enic illin,am oxic illin,cep hap irin we re3,4and8ng/mL,resp ec tive ly.Through de tec ting the sam e sp ec im en g roup(n=120),it was p roved tha t the es tab lished kit had no d iffe rence to the kit of ZEU- INMUNO TEC comp any in sens itivity and its sup e rior to TTC m e thod on sens itivity and convenience.As a result,it could be used to de tec t antib iotics in m ilk.

antib iotic res idue;de tec tion;m ilk;Bac illus S tea rothe rm op hillus

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0321-03

牛奶是老少皆宜的營養品,但是在奶牛的養殖過程中,為了治療和預防奶牛乳腺炎和其它細菌感染性疾病,一些養殖戶使用了青霉素等抗生素,進而在牛乳中產生了抗生素殘留;更有一些不法奶農為防止細菌的大量繁殖和牛奶的酸敗人為添加抗生素,原料奶中抗生素殘留會影響奶制品品質,長期食用會危害人體健康。因此,牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視,各國(均制定了相應的標準,建立了多種檢測手段)也在通過各種檢測技術查處有抗奶,來保障人們飲用牛奶的衛生和安全[1-2]。國外已有相關的抗生素檢測試劑盒上市,但價格昂貴。而國內的商品化試劑盒較少,目前我國常采用的檢測方法為 TTC法,此方法結果可靠,檢測費用較低,一般實驗室都能操作。但因其檢測周期長、操作繁瑣、結果辨別不準確等缺點,影響了在實際中的應用[3-4]。因此研制簡單有效、價格低廉的檢測試劑盒有廣闊的市場前景。本實驗室研究制作了嗜熱脂肪芽孢桿菌 96孔板試劑盒,可簡便、準確地檢測牛奶中的抗生素殘留。其原理是嗜熱脂肪芽孢桿菌對多種抗生素尤其是β-內酰胺類抗生素具有高度敏感性,如果被檢樣品中含有抗生素殘留,這些物質擴散到基質中,抑制了芽孢的萌發和繼續繁殖,阻斷糖類轉化形成有機酸,通過加入指示劑的顏色變化可進行辨別。實驗對于營養培養基成分、指示劑及芽孢添加量等條件進行了探索,使檢測結果達到國家標準規定的靈敏度。

2009-08-24 ＊通訊聯系人

謝莉(1976-),女,工程師,主要從事食品安全方面的研究。