桑葉多酚氧化酶的固定化及酶學性質研究

楊 洋,黃 濤,關紅艷,吳小玉

(1.廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

桑葉多酚氧化酶的固定化及酶學性質研究

楊 洋1,黃 濤2,關紅艷2,吳小玉1

(1.廣西大學生命科學與技術學院,廣西南寧 530004; 2.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

研究了桑葉多酚氧化酶(PPO)的動力學特性,結果表明,其最適溫度為 40℃,最適 pH為 7.0,酶動力學參數Km=0.093mol/L。用濃度質量分數為 4%海藻酸鈉、體積分數為 0.2%戊二醛、0.2mol/L的 CaCl2固定多酚氧化酶,固定時間 2h,交聯時間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應溫度為 50℃,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

桑葉,多酚氧化酶,動力學,固定化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 PPO 實驗室自制;考馬斯亮藍 G-250、鄰苯二酚、焦性沒食子酸、間苯二酚、對苯二酚、二苯胺、對氨基苯磺酸、聚乙二醇 20000、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺 (Acr)、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、殼聚糖、醋酸、石蠟、硅藻土、海藻酸鈉、戊二醛、Tween 80、KH2PO4、Na2HPO4等化學試劑 均為分析純。

掃描電子顯微鏡 S-3400N 購自日本日立公司;PL2002電子天平 購自特勒-托利多儀器有限公司;UV1240型紫外分光光度計 購自日本島津公司;BECK MAN J2-MC高速冷凍離心機 購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 掃描電子顯微鏡觀測 PPO結構

將桑葉 PPO冷凍干燥樣品固定在觀測臺上,然后噴金,以掃描電子顯微鏡 S-3400N觀測 PPO分子形態,同時觀測其均一性程度。

1.3 PPO的 SDS-PAGE電泳純度鑒定、分子量測定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的純度和測定分子量。

1.4 酶活性和蛋白質含量測定方法

1.4.1 桑葉 PPO活性測定 參照楊昌鵬等人報道的分光光度計比色法[7],取磷酸鹽緩沖液 3.9mL,加入0.02mol/L焦性沒食子酸溶液 1mL,PPO粗酶液0.1mL混勻后在 30℃下反應 5min,在 420nm波長下測定其吸光度的變化,每 60s記錄一次OD值隨時間的變化,以最初直線段的斜率計算酶活力。一個酶活力單位定義為：在測定條件下,每分鐘引起吸光度改變 0.001所需的酶量。

1.4.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法(Bradford法)[8],以牛血清蛋白為標準,在 595nm波長下測定酶液的蛋白質含量;但在層析過程中以收集液的吸光光度值 (OD280)來表示蛋白質含量的變化。

1.5 酶學性質研究

1.5.1 底物專一性 測定底物專一性時,分別以0.02mol/L的鄰苯二酚、焦性沒食子酸、間苯二酚、對苯二酚、二苯胺、對氨基苯磺酸為底物,測定 PPO活性。

1.5.2 動力學參數米氏常數 Km測定 取 5組試管,每組 4支試管,1支空白,3支平行管。每支試管分別加入 3.9mL的磷酸鹽緩沖溶液,每組分別加入 30、20、10、5、1mmol/L焦性沒食子酸為底物,0.1mL酶液,在 30℃條件下反應 5min后,測定 420nm處的吸光度,以反應物 420nm處吸光度直接表示活力大小。測定 PPO活性,根據 Lineweawer-Burk[9]雙倒數作圖法計算其Km值。

1.6 桑葉 PPO的固定化

1.6.1 固定化方法

1.6.1.1 樹脂法 取 0.5g樹脂AB-8,加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液 (0.1mol/L,pH6.0)1mL,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度0.1%,30℃下交聯 8h,用蒸餾水洗去游離酶和殘余的戊二醛,于 4℃下儲存,備用。

1.6.1.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法 分別往適量的硅藻土中加入多酚氧化酶 4mg,和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%,30℃下交聯 8h,過濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。于4℃下儲存,備用。

1.6.1.3 殼聚糖微球固定法 稱取適量的殼聚糖微球載體,加入適量的多酚氧化酶液中,30℃下恒溫振蕩 1h,于4℃下放置過夜,棄去上層溶液,用大量蒸餾水反復洗滌,洗去游離酶,于 4℃下儲存,備用。

1.6.2 固定化酶的酶學性質

1.6.2.1 固定化酶的最適反應 pH 固定化酶活力測定體系用 pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的一系列緩沖溶液,測定不同 pH下固定化酶的活力,比較不同 pH下固定化酶和游離酶的最佳反應pH。

1.6.2.2 固定化酶的最適反應溫度 分別在 20、30、40、50、60、70℃溫度下測定固定化酶的活力,比較不同溫度下固定化酶和游離酶的最適反應溫度。

2 結果與分析

2.1 觀測桑葉 PPO結構

桑葉 PPO的掃描電子顯微鏡觀測如圖 1所示,從圖中可以看到,PPO酶液經過 Sephadex G-75凝膠柱層析分離以后,得到比較均一的結構。同時也可以看到桑葉 PPO為纖維狀蛋白,根據觀測結果計算可知,桑葉 PPO分子長度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。具有酶活性的蛋白質通常由幾百個氨基酸組成,其作用的底物大多數為小分子,因此酶分子與底物直接發生作用的僅僅只有一小部分氨基酸側鏈,這些與酶催化活性有關的氨基酸側鏈稱為酶的活性中心。即酶活性中心是指酶與底物結合并使之反應的區域,一般位于酶分子表面的裂縫或凹槽,往往是疏水區,可容納一個或多個小分子底物或大分子底物的一部分,這就是酶的活性中心。從圖 1可以看到,在桑葉 PPO的晶體兩端都有凹槽,應為此酶的活性中心。

圖1 掃描電子顯微鏡觀測桑葉 PPO結構圖

天然狀態的酶具有完整的三維空間結構,其中活性部位跟其他結構部位相比,具有較大的柔性,也就是說酶活性部位基因的運動性較大。當低濃度變性劑作用時,酶分子整體剛性部分構象保持完整,而較柔性的活性部位的局部結構已發生明顯變化,如活性基團的相互靠近和立體取向受到破壞,導致酶活性的喪失。

2.2 桑葉 PPO的純度鑒定及分子量測定

桑葉 PPO經過 Sephadex G-75凝膠層析后,透析,濃縮,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,見圖 2。發現只有一條譜帶,說明此酶已經達到電泳純。有關桑葉多酚氧化酶同工酶的鑒定尚待進一步研究。

圖2 蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜

電泳結果如圖 2所示,可以看出桑葉 PPO的條帶堆滯在 47kDa附近,因此分子量測定約為 47kDa。

2.3 PPO酶學性質研究

2.3.1 PPO的底物專一性 從表 1可以看出,桑葉PPO迅速地催化焦性沒食子酸的酶促氧化反應,催化鄰苯二酚的氧化反應速率為焦性沒食子酸的 2.5倍,而對對苯二酚、沒食子酸、間苯二酚、對氨基苯磺酸的活性較小,對二苯胺則完全無催化活性。這表明焦性沒食子酸為桑葉 PPO的主要氧化底物。

表1 不同底物對酶活性的影響

2.3.2 動力學參數米氏常數 以焦性沒食子酸為底物,緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH6.0,0.02mol/L),底物濃度分別為 30、20、10、5、1mmol/L。總反應體積都為3.9mL。在 30℃下反應 5min,以反應物 420nm處吸光度測定酶活。以 1/[S]和 1/V為橫縱坐標作Lineweaver-Burk圖 (圖 3)。求得該 PPO催化焦性沒食子酸水解的 Km為 0.093mol/L。因此,米氏常數Km值實際上也是酶與底物親合力大小的反映,即Km值越小,酶與底物的親合力越大。

圖 3 Lineweaver-Burk圖

2.4 PPO的固定化研究

2.4.1 固定化載體的優化 從表2看出,樹脂法吸附性差,不能將 PPO很好地吸附,因此不能將 PPO固定化;采用殼聚糖微球固定法將 PPO固定化,吸附能力過強,通透性也差,固定化酶活性也隨之下降;以硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法比殼聚糖微球固定法的效果好,能將 PPO很好地固定。

表 2 不同載體的固定化多酚氧化酶活力

分別往適量的硅藻土中加入 PPO 4mg和磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)1mL,混合均勻,室溫下,于搖床中振蕩吸附 6h,加入戊二醛至終濃度 0.1%(體積分數),30℃下交聯 8h,過濾洗滌,洗去游離酶和殘余的戊二醛,加入質量分數 4%海藻酸鈉,混合均勻,用注射器滴入質量分數 2%的氯化鈣溶液中,立即可以見到小球形成,且由透明變成白色并沉淀,用濾紙濾出小球體,并用相同的 CaCl2溶液浸泡 2h左右固定化,濾出小球體,操作完畢后,移入 4℃的冰箱中硬化 2h,然后用蒸餾水洗滌,加入戊二醛溶液交聯 4h,再用蒸餾水洗滌,得到固定化酶。

2.4.2 硅藻土吸附海藻酸鈉包埋法固定 PPO條件的優化

2.4.2.1 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響 從圖 4可以看出,海藻酸鈉濃度低時,酶泄漏嚴重,清洗固定化酶小球時,酶的損失較多,酶活力下降,酶活力隨海藻酸鈉濃度的增大而提高,當海藻酸鈉濃度達到質量分數 0.4%時,酶活力達到最大值,之后酶活力略有下降,可能是固定化酶負載量過大,使得載體強度不夠,酶反而容易泄露。加上海藻酸鈉濃度高時,微環境效應和擴散阻力對反應影響更大,且不易操作,很難將酶液從注射器中擠出。故選用質量分數 0.4%海藻酸鈉對酶進行固定化較為適宜。

圖 4 海藻酸鈉濃度對固定化酶活性的影響

2.4.2.2 固定化時間對固定化酶活性的影響 固定化時間對固定化酶活力的影響如圖 5所示,可以看出,當固定化時間為 2h時,固定化酶活力最高,固定化時間過短或過長,固定化酶活力均有不同程度的下降。究其原因,固定化酶的活性受到兩個方面的綜合影響,一方面隨著固定化時間的延長,多酚氧化酶固化越來越充分,酶在海藻酸鈣凝膠中包埋得更牢固,有利于固定化酶活力的提高;另一方面,隨著固定化時間的延長,Ca2+對固定化酶的抑制作用加劇,使酶活力下降。

圖 5 固定化時間對固定化酶活性的影響

2.4.2.3 交聯時間對固定化酶活性的影響 實驗結果如圖 6所示,在實驗范圍內,交聯時間對固定化酶活力的影響較小,固定化酶交聯不同時間后,其相對酶活力均在 75%以上,交聯時間為 4h時,固定化乳酸氧化酶相對酶活力最高,交聯時間過長或過短,酶活力均有所下降。這可能是因為分子間交聯反應達飽和后,隨著時間的延長,開始發生酶分子內交聯,增加了酶分子間的空間位阻,直接影響到酶活性中心對底物的定位作用。且內擴散阻力也增大,從而使固定化后有部分酶蛋白失活。

圖 6 交聯時間對固定化酶活性的影響

2.4.3 固定化酶的酶學性質

2.4.3.1 pH對固定化酶活性的影響 酶存在于生物體中,具有很高的催化活性。但是它對于所處的微環境也有很高的要求。例如溶液的酸堿性對于酶的活力具有很大的影響。我們實驗了在不同的 pH條件下,液相以及固定化多酚氧化酶的活力,所得結果如圖7所示。

圖7 pH對固定化和游離 PPO活性的影響

由圖 7可以看出,固定化酶的最適 pH為 6.0,與游離酶相比,其最適 pH發生了變化,由 7.0變為了6.0。固定化酶的最適 pH較游離酶的最適 pH發生了偏移,可能由于兩種因素造成：一是載體含有大量帶電基團,其多電解質的微環境影響著酶的活力;二是由于酶的作用產物導致在固定化酶顆粒內建立一種帶電的微環境。

2.4.3.2 溫度對固定化酶活性的影響 不同酶的熱穩定性不同。在溫度低于最適反應溫度時,酶反應速度隨著溫度的升高而增加,這時酶蛋白的熱變性不是主要的;在溫度超過最適溫度時,反應速度反而會隨著溫度的升高而下降,這時酶熱變性造成的影響比升溫引起反應加速的影響更大。固定化多酚氧化酶最適反應溫度曲線和熱穩定性曲線分別如圖 8和 9所示。

圖8 溫度對固定化和游離 PPO活性的影響

圖9 固定化和游離 PPO的熱穩定性

圖 8中相對酶活指不同溫度條件下,加入等量酶液或固定化酶反應的表觀酶占其中最大值的百分比。游離酶的活力隨著溫度的上升迅速增大,到達40℃左右達到最大,說明游離酶的最佳反應溫度在40℃。固定化酶的最佳反應溫度為 50℃。游離和固定化酶在 40℃之前保持著良好的熱穩定性,但是溫度到達 60℃時,游離酶的活力損失嚴重,而固定化酶仍然保持著較高的酶活力。由此可見,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

3 結論

通過對多酚氧化酶性質的研究,結果表明：用掃描電鏡觀察經過分離純化的桑葉多酚氧化酶,其為纖維狀蛋白,分子長度在 4～12μm之間,寬度在0.5～1.5μm之間。桑葉多酚氧化酶的分子量約為47kDa;最適底物為焦性沒食子酸;最適 pH為 7.0;最適溫度為 40℃。PPO的 Km值為 0.093mol/L。

研究了桑葉多酚氧化酶的固定化：用濃度質量分數為4%海藻酸鈉、體積分數0.2%戊二醛、0.2mol/L的CaCl2固定多酚氧化酶,固定時間 2h,交聯時間 4h,能使固定化多酚氧化酶的活力達到最大。固定化酶的最適 pH為 6.0,固定化酶的最佳反應溫度為 50℃,固定化酶對溫度的敏感度降低,溫度變化對固定化酶酶活力的影響不大。

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Study on the immobilization of polyphenol oxidase of mulberry leaf

YANG Yang1,HUANG Tao2,GUAN Hong-yan2,W U X iao-yu1
(1.College ofLife Science and Technology,Nanning 530004,China; 2.College ofLight Industry and Food Engineering.,GuangxiUniversity,Nanning 530004,China)

Kine tic cha rac te ris tics of p olyp henol oxidase(PPO)in m ulbe rry leaf we re s tud ied.The result showed tha t the op t im um pH and temp e ra ture was7.0and40℃,resp ec tive ly,and the M ichae liscons tant was0.093m ol/L.The imm ob iliza tion of PPO from m ulbe rry leaf was resea rched.The ac tivity of imm ob ilized PPO reached its m ax im um when4% sod ium a lg ina te,0.2% g luta ra ldehyde,0.2m ol/Lwe re used to imm ob ilize the PPO,in an mim ob iliza tion t im e of2h and c ross linking t im e of4h.The op t im um pH and temp e ra ture was6.0,and 50℃resp ec tive ly,and the enzym e becam e less suscep tib le to the temp e ra ture,the temp e ra ture d id little affec t to the enzym a tic ac tivity.

m ulbe rry leaf;p olyp henol oxidase;kine tics; imm ob iliza tion

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)02-0245-05

多酚氧化酶是遍布動植物體內的一種胞內酶,在植物體內主要與抗病等有關[1-2];在食品保鮮方面,多酚氧化酶(PPO)與果蔬的褐變、黑色素合成有關,它可以氧化多酚成醌,使產品顏色變深,并使風味產生一定變化;PPO與昆蟲的發育有密切關系,可以通過研究它開發殺蟲農藥[3]。PPO能促使兒茶素類物質氧化形成茶黃素、茶紅素和其它的氧化聚合物,同時伴隨兒茶素的氧化,氨基酸、胡蘿卜類等香氣前體發生偶聯氧化,產生各種各樣的香氣化合物,并形成紅茶的基本風味[4]。由于 PPO潛在的應用背景及對人體健康的影響和環境保護方面的因素,故對它的研究具有廣泛的理論意義和實際應用價值。人們做了很多的關于多酚氧化酶的研究工作,其中最受關注的問題集中在不同介質及不同溫度、不同條件下的多酚氧化酶的活性研究。但對于桑葉多酚氧化酶的固定化研究尚未見報道。桑樹是我國重要的經濟作物,桑葉不僅是家蠶的最好飼料,而且桑葉和桑根等又自古入藥[5-6]。為此,本文以桑葉 PPO為研究對象,研究桑葉 PPO酶學性質和固定化,為桑葉PPO的亞細胞定位及進一步開發利用桑樹資源和桑葉多酚氧化酶的開發應用提供依據。

2009-03-23

楊洋(1956-),女,教授,研究方向：天然植物生物活性研究。