響應面法優化月見草籽油中γ-亞麻酸的富集工藝參數

歐陽輝，張永康，陳功錫，田啟建

（吉首大學/植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首416000）

響應面法優化月見草籽油中γ-亞麻酸的富集工藝參數

歐陽輝，張永康，陳功錫，田啟建

（吉首大學/植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首416000）

利用響應面法對月見草籽油中γ－亞麻酸的富集工藝參數進行優化。在單因素實驗基礎上選取實驗因素與水平，根據中心組合（Box－Benhnken）實驗設計原理采用四因素三水平的響應面分析法，依據回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以富集產物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為響應值作響應面分析，得出最佳工藝條件為：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時間為15.6h，此工藝條件下產品中γ－亞麻酸含量可達53.60%，γ－亞麻酸回收率達94.48%。

月見草，γ－亞麻酸，尿素包合法，富集，響應面

1.1 材料與儀器

超臨界萃取月見草籽油 吉首大學超臨界流體萃取實驗室提供；無水硫酸鈉、石油醚、無水乙醇、尿素等 均為分析純。

GC－2010型氣相色譜儀、GCMS－QP2010質譜儀（NIST05.LIB標準庫） 日本島津公司；FA2004電子天平 上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；HH－2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RE52－99旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酸組成及含量測定

1.2.1.1 實驗條件 GC條件：GC－2010型氣相色譜儀，色譜柱2m×4mm，填充80～100目ChromosorbW，涂以8%（W/W）二乙二醇琥珀酸酯（DEGS）（3mm× 2.5m），柱溫 210℃，進樣器溫度 260℃，氮氣流速40mL/min。MS條件：GCMS－QP2010，EI離子源，源溫200℃，電子能量70eV，連接器溫度280℃，運行時間35.5min，質量掃描范圍（m/z）：29～600。

1.2.1.2 操作步驟 稱取30～100mg（約2～6滴）油脂，置入10mL量瓶內，加入1～2mL正己烷和苯的混合溶劑（1∶1），搖動使油脂溶解。加入1～2mL氫氧化鉀（0.4mol·L－1）－甲醇溶液，混勻。在室溫靜置5～10min后，加蒸餾水使全部苯甲酯溶液升至瓶頸上部，放置待澄清（如上清液渾濁而又急待分析時，可滴入數滴無水乙醇，1～2min內即澄清）。吸取上清液，在室溫下吹入氮氣使其濃縮，所得濃縮液即可用于氣相色譜分析。

1.2.2 混合脂肪酸的制備 超臨界萃取月見草油按一定比例加入3%的NaOH－乙醇溶液，置于錐形瓶中，在60℃的水浴中加熱回流（N2保護），磁力攪拌1h，得皂化液。冷卻至室溫后，加入適量水使生成的少量皂完全溶解，用10%的HCl溶液酸化混合液至pH2～3，加正己烷萃取，分層，去下層的水層。有機相水洗至中性，加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，用旋轉蒸發器蒸出溶劑，得到混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合法富集γ－亞麻酸響應面法實驗設計

稱取混合脂肪酸40g，按照相應比例依次加入乙醇、尿素，其中尿素分 3次加入，加入量遞減。60～70℃加熱攪拌1h至溶液透明澄清。室溫冷卻30min后，于不同溫度下進行包合反應，析出尿素包合結晶物，一定包合時間后取出，迅速減壓抽濾除去結晶，濾液經回收乙醇、稀酸及飽和鹽水洗后得到富集γ－亞麻酸產物，稱重后取樣測定γ－亞麻酸含量。

γ－亞麻酸回收率（%）=（富集產物質量×富集產物中γ－亞麻酸含量/混合脂肪酸質量）×100%

根據前期預備單因素實驗，采用 Design Expert7.16統計軟件，利用響應面方法（RSM）中的Box－Behnken設計進行實驗設計，以包合溫度（℃）、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）和包合時間（h）四個因素為自變量，以富集產物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為響應值，每個因素取三水平，以－1、0、+1編碼，并根據單因素實驗結果選定三因素的零水平和波動區，采用Box－Beheken實驗設計實際考察的變量及其實驗水平編碼見表1。

2 結果與討論

2.1 超臨界萃取月見草油各脂肪酸的組分和含量

超臨界CO2萃取月見草籽油脂肪酸經甲酯化處理后，通過色譜數據分析，月見草籽油脂肪酸的組成見表2。

表1 中心組合設計因素水平表

表2 超臨界萃取月見草油中組分含量結果表（%）

2.2 月見草籽油提取率中心組合設計實驗結果及響應面優化分析

按照Box－Beheken實驗設計原理的實驗方案進行四因素三水平實驗，實驗結果見表3。

表3 Box－Behnken實驗設計及結果

表3中，實驗號1～24是析因實驗，實驗號25～29是中心實驗。29個實驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構成的三維頂點；零點為區域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。采用Design－Expert軟件對所得數據進行回歸分析，回歸分析結果見表4、表5。

2.3 回歸模型的建立及分析

采用Design－Expert軟件對表4、表5的實驗數據進行多元回歸擬合，得到富集產物中γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率對包合溫度、尿素/混合脂肪酸（w/w）、95%乙醇/尿素（v/w）和包合時間四個因素的二次多元回歸方程如下：

產物中γ－亞麻酸含量：

表4 響應面模型方差分析表（γ－亞麻酸含量）

表5 響應面模型方差分析表（γ－亞麻酸回收率）

γ－亞麻酸的回收率：

2.4 工藝條件的確定

根據回歸模型通過Design Expert軟件分析得出，富集產物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率最高時的最佳工藝條件是：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時間為15.6h，根據上述條件進行3次重復實驗，得出實際富集產物的γ－亞麻酸含量為53.60%，γ－亞麻酸的回收率為94.48%，與預測值基本一致，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于對尿素包合法富集月見草籽油中γ－亞麻酸的工藝進行回歸分析和參數優化。

3 結論

3.1 通過響應面分析優化的尿素包合法富集超臨界萃取月見草籽油中γ－亞麻酸的最佳條件：包合溫度為－10℃、尿素/混合脂肪酸（w/w）為3∶1、95%乙醇/混合脂肪酸（v/w）為8∶1，包合時間為15.6h，產品中γ－亞麻酸含量可達 53.60%，γ－亞麻酸回收率達94.48%。

3.2 尿素包合法富集超臨界萃取月見草籽油中γ－亞麻酸，條件溫和、工藝簡單、成本低廉，是制備高純度γ－亞麻酸的有效辦法，為實現工業化生產提供了經濟可行的工藝技術參考，具有廣闊的前景。

［1］李國棟，范偉，陸國浩，等.月見草油的研究概況［J］.藥學實踐雜志，2003，21（3）：171－173.

［2］周立新，黃鳳洪，李文林，等.α－亞麻酸與γ－亞麻酸［J］.西部糧油科技，2000，25（6）：46－18.

［3］翁新楚，董新偉，任國譜.脲包法在脂類分離技術中的應用［J］.中國油脂，1994，19（6）：40－44.

［4］楊文雄，高彥祥.響應面法及其在食品工業中的應用［J］.中國食品添加劑，2005（2）：68－71.

［5］LI Q H，FU C L.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein［J］.Food Chemistry，2005，92（4）：701－706.

Study on optimization of γ－linolenic acid enrichment from evening primrose seeds oil by response surface methodology

OUYANG Hui，ZHANG Yong－kang，CHEN Gong－xi，TIAN Qi－jian
（Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province/Jishou University，Jishou 416000，China）

Based on single factor tests，the optimum enriching condition of γ－linolenic acid from evening primrose seeds oil with urea adduct method was obtained through Box－Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum enriching condition of polysaccharides were as follows：inclusion temperature－10℃，ratio of urea adduct to fatty acid（w/w）was 3∶1，ratio of 95%ethanol to fatty acid（v/w）was 8∶1，inclusion time 15.6h.Under such condition，the purity of γ－linolenic acid was 53.60%，the rate of γ－linolenic acid recovery was 94.48%.

evening primrose；γ－linolenic acid；urea adduct method；enrichment；response surface methodology

TS225.1+4

B

1002－0306（2010）12－0243－04

月見草（Oenothera biennis L.）系柳葉菜科1年或2年生草本植物，俗名山芝麻，由于夜間開花，花朵黃色，淡香幽雅，又名夜來香。據文獻資料記錄，月見草種子含油20%～30%，其中γ－亞麻酸約7%～14%左右［1］。γ－亞麻酸是人體必需的不飽和脂肪酸，是人體內具有重要的生理活性的組成物質［2］。尿素包合法是不飽和脂肪酸的常用富集方法，其基本特點是可將混合物脂肪酸按飽和度的差異進行分離。其優勢在于：設備簡單，工藝簡便，不在高溫下進行反應，脲包物形成后，還可有效地保護雙鍵不受氧化，不會對不飽和脂肪酸的分子結構和理化性質產生影響，能較完全地保留其營養與生理活性［3］。響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業等方面［4］。它與正交實驗設計法不同，具有實驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優點［5］。本研究以富集產物的γ－亞麻酸含量和γ－亞麻酸的回收率為評價指標，以包合溫度、尿素/混合脂肪酸比例、95%乙醇/混合脂肪酸比例和包合時間四個因素為自變量，利用響應面分析法優化尿素包合法富集月見草籽油中γ－亞麻酸的工藝條件，得到最佳富集參數，為更好地利用我國月見草資源，為實現工業化生產提供實驗基礎和技術依據。

1 材料與方法

2009－11－13

歐陽輝（1979－），男，理學學士，實驗師，主要從事天然生物活性成分研究。

湖南省教育廳重點資金資助項目（02A037）。