乳酸菌發酵劑菌體自溶及產酶特性

孫 潔，呂加平，劉 鷺，張書文

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193；2.農業部規劃設計研究院，北京100125）

乳酸菌發酵劑菌體自溶及產酶特性

孫 潔1，2，呂加平1，*，劉 鷺1，張書文1

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193；2.農業部規劃設計研究院，北京100125）

使用自溶度不同的乳酸菌發酵劑來控制產品的成熟周期及感官風味，具有良好的指導意義和實用價值，本文通過對嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和乳酸乳桿菌自溶度的研究表明，菌體自溶特性除了與菌株密切相關外，培養條件也會對其產生一定影響；在一定范圍內，菌體自溶度隨培養溫度和pH的升高而增大，但超出這一范圍，過高的培養溫度和pH又會抑制菌體的自溶；乳酸菌自溶速度越快，產生并釋放的蛋白酶和脂肪酶酶活性達到峰值所需時間就越短；相同培養條件下，乳酸乳桿菌產脂肪酶酶活性最高，三個菌株（SY15、SY15－3、SY26）產酶活性達到24.11～46.23U；德氏乳桿菌保加利亞亞種產蛋白酶活性最高，四個菌株（LD1、LD1－3、LD3、LD3－3）產酶活性最低為27.63U（LD3－3）、最高為45.22U（LD1－3）。在乳酸菌發酵劑的使用過程中，應根據實際需要對自溶度不同的菌株進行選擇。

乳酸菌，自溶，脂肪酶，蛋白酶

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株 均來自于本實驗室保藏菌株，經APIOR試劑盒（生物－梅里埃公司，法國）鑒定，置信區間均在98%以上，分別為嗜熱鏈球菌（Streptococcus salivarius ssp.），標記為GS1、GS2、GS3；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus），標記為 LD1、LD1－3、LD3、LD3－3；乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis ssp.Lactis），標記為SY15、SY15－3、SY26。菌株純化后用冷凍干燥機（LGJ－10中國北京四環）真空凍干成粉，保存于－80℃低溫冰箱，使用時經由MRS肉湯培養基（中國北京陸橋）于37℃條件下培養活化3代，儲存于4℃冰箱備用。

1.2 菌株培養

活化菌株于MRS肉湯培養基37℃培養至穩定期，離心收集菌體細胞（4000r/min，10min），以無菌水洗滌兩次，離心收集菌體細胞備用。

1.3 不同溫度條件對菌株自溶的影響

將1.2中所得菌體細胞重懸于 PBS緩沖液（50mmol/L pH6.5）中，調整菌液吸光值（OD650nm）至1.0左右，分別置于4、10、25、37、45℃溫度條件下進行培養，于0、2、4、8、12、24h時取樣測定。

1.4 不同pH條件對菌株自溶的影響

將1.2中所得菌體細胞重懸于pH分別為4.5、5.5、6.5、7、7.5的PBS緩沖液（50mmol//L）中，置于37℃溫度條件下培養，其他條件同1.3，于0、2、4、8、12、24h時取樣測定。

1.5 菌體自溶度的檢測

將1.3和1.4中所得菌液置于石英杯中，使用分光光度儀（U－3010 Hitachi日本）測定其波長為650nm處的吸光度，自溶度計算公式如下［6］。

其中：A1為菌液吸光值；A2為菌液初始吸光值［7］。

1.6 蛋白酶活性的測定

其中：ΔA為樣品與空白對照的吸光值之差；K為吸光常數；n為反應總體積；t為反應時間。根據本次實驗中酪氨酸標準曲線（圖1所示）確定K=76.89。

1.7 脂肪酶活的測定

脂肪酶活的測定采用堿滴定法［9］，略有改進：將4%聚乙烯醇與化學純級橄欖油按3∶1的比例混合，冷卻至4℃后用組織搗碎機乳化10min，使其成為乳白、分散均勻的底物乳化液，冰箱保存備用。測定時將5mL磷酸緩沖液（0.025mol/L，pH 7.5）和4mL上述乳化底物置于100mL三角瓶中混合，于40℃水浴5min；然后加入1mL待測菌液搖勻繼續水浴，精確計時15min，立即向三角瓶內加入95%乙醇15mL以終止反應；向三角瓶內滴加1%酚酞指示劑1～2滴，使用微量滴定管，用0.01mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，記錄耗堿量；以未加菌液的體系滴定值設置空白對照。酶活力定義為：在40℃、pH 7.5的條件下，脂肪酶每分鐘分解脂肪產生1μmol游離脂肪酸所需要的酶量（單位）定義為一個脂肪酶酶活性單位U。計算公式為：

圖1 酪氨酸標準曲線

式中：A為NaOH消耗量；B為空白對照組NaOH消耗量；t為反應時間。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的自溶特性

2.1.1 不同菌株間自溶度差異 在37℃條件下將各菌株懸浮于PBS緩沖液（50mmol/L pH6.5）中孵育，不同時間取樣測定菌株自溶度，結果如圖2所示。

圖2 不同菌株在相同環境中的自溶度差異

不同菌種的自溶度有很大差異，在pH 6.5、37℃條件下培養24h，德氏乳桿菌保加利亞亞種的自溶度最大，其四個菌株的自溶度分別在42%～61%之間；乳酸乳桿菌的自溶程度最小，三個菌株的自溶度均在11%以下，其中菌株SY15在24h之內幾乎沒有發生自溶。同種乳酸菌的不同菌株之間自溶度也有一定差異，例如嗜熱鏈球菌三個菌株的自溶度分別為20.8%（GS2）、6.8%（GS1）和9.6%（GS3）。

2.1.2 培養溫度對乳酸菌自溶的影響 培養溫度對乳酸菌的自溶有較大影響，以桿菌LD1－3和球菌GS2為例，結果如圖3所示。

在4℃和15℃的低溫條件下，乳酸菌的生長基本處于停滯狀態，此時菌體的自溶度也降至最低。在25～42℃范圍內，乳酸菌的自溶程度明顯隨環境溫度的升高而增大，菌株LD1－3和GS2在42℃條件下孵育24h，較25℃條件下的自溶度分別提高了43.6%和41.5%。較高的環境溫度對桿菌LD1－3自溶的促進作用比對球菌GS2更明顯。在高溫環境中，乳酸菌的自溶呈現一種先揚后抑的趨勢，在孵育初期，55℃條件下菌株自溶度比42℃條件下高，孵育后期前者的自溶度又開始低于后者?？梢娺^高或過低的培養溫度，都因其不利于菌體生長而影響了菌體自溶酶的轉錄表達，或抑制其活性，從而降低了菌體的自溶程度。

2.1.3 環境酸度對乳酸菌自溶的影響 乳酸菌培養的環境pH對菌體的自溶也有一定影響，圖4所示為菌株LD1與GS2在不同pH條件下孵育的自溶情況。

(2)改革工藝，減少產塵量。選煤廠適當提高入選上限，減少煤的破碎量，或適當調整破碎機的工藝參數，盡量減少過粉碎，均可大大減少煤塵數量。

圖3 不同培養溫度對菌株自溶的影響

圖4 不同環境pH對菌株自溶的影響

關于環境酸度對乳酸菌自溶的影響的研究結論不盡相同，Tetsuya等學者［5］認為乳酸菌在低pH條件時自溶程度較大；但是李艾黎等［10］的研究又認為較低的pH會抑制菌體的自溶。

本研究發現：較高的pH更有利于菌體的自溶，尤其是在菌體培養初期（0～8h），pH的升高可顯著增大菌體自溶程度，例如菌株LD1在pH4.5的條件下培養24h，其自溶度為18.8%；當pH升至7時，自溶度則達到了46.3%；同樣，菌株GS2在pH4.5與pH7條件孵育的自溶度分別為9.4%與25.5%，二者均有一倍左右的增長。但是當pH繼續增大時，這種趨勢又發生了改變：在pH7.5孵育時，菌株LD1和GS2的自溶程度都較pH7時有所降低，這一趨勢在其他菌株實驗中均有體現。由于乳酸菌的自溶是一種自發的生理過程，這一過程受很多因素影響，有著復雜的調控機制，不同菌株的自溶行為對環境酸度的敏感度不同，同時還可能與培養時所用緩沖液的種類、濃度及其他環境因素有一定關系，因此才出現pH對自溶影響結果的矛盾報道。

通過上述實驗發現：在37℃、pH 6.5環境條件下，大多數乳酸菌的自溶程度都處于一個中間、穩定的狀態，因此也將其確定為下一步實驗的孵育條件。

2.2 乳酸菌產生脂肪酶的活性與自溶度的關系

不同乳酸菌產生脂肪酶的活性如圖5所示。

圖5 不同乳酸菌產生的脂肪酶酶活性

在培養過程中，不同乳酸菌產生脂肪酶活性的峰值以及到達峰值的時間都有很大差別，由圖5可見，乳酸乳桿菌的脂肪酶活性最高，三個菌株產酶的酶活在24.11～46.23U范圍內；德氏乳桿菌保加利亞亞種產脂肪酶的活性最低，在15.12～18.17U范圍內；嗜熱鏈球菌的脂肪酶活性基本上在26U左右，雖然實驗菌株自溶程度并不相同，但其產生脂肪酶的酶活峰值卻十分相近。圖6中所示即為嗜熱鏈球菌三菌株在自溶期間脂肪酶活性的變化。圖中可見，在37℃、pH 6.5條件下，三個菌株的脂肪酶活性隨著培養時間的推移而逐步增大，達到峰值后又有一定程度的下降。乳酸菌產脂肪酶酶活性到達峰值的時間與菌株的自溶度有一定相關性，菌株GS1、GS2和GS3在孵育24h后的自溶度分別為6.8%、20.8%和9.6%，由圖中可知，自溶度較大的菌株GS2，其脂肪酶活性達到峰值所需時間比自溶度小的菌株GS1、GS3所需時間短。

圖6 不同嗜熱鏈球菌菌株自溶期間脂肪酶活性的變化

2.3 不同乳酸菌產生蛋白酶活性與自溶度的關系

不同乳酸菌產生蛋白酶的活性如圖7所示。

圖7 不同乳酸菌產生的蛋白酶酶活性

由圖7可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種產蛋白酶的酶活性遠高于其余兩種乳酸菌，其中3個菌株的酶活性均在40～46U之間；嗜熱鏈球菌產蛋白酶的活性在12.66～15.23U之間；乳酸乳桿菌的脂肪酶活性最高，但其蛋白酶的活性卻最低，均在7.63～10.11U之間。圖8中所示為GS1、GS2和GS3在自溶期間蛋白酶活性的變化情況。由圖中可見，在37℃、pH6.5條件下，三個菌株的蛋白酶活性隨孵育時間的推移而逐步增大，達到峰值之后又開始下降。自溶度高的菌株GS2產蛋白酶酶活到達峰值的時間約為36h左右，而自溶度較低的菌株GS1約為45h左右。

圖8 不同菌株嗜熱鏈球菌自溶期間蛋白酶活性變化

3 結論

不同菌種或菌株其自溶程度不同，同時菌株的生長環境對自溶也有一定影響：過高或者過低的培養溫度和pH都可抑制乳酸菌的自溶，每種乳酸菌都存在一個最適宜的培養條件，在該條件下菌體繁殖最穩定。通常在高于45℃的培養條件下，菌體在對數生長期因自溶過快會導致活菌數急劇下降，不利于乳酸菌的增殖；在4～10℃低溫條件下，菌體幾乎不發生自溶。培養環境pH的升高也會增大菌體的自溶程度，過酸的環境則會抑制菌體自溶。

相同培養條件下，乳酸乳桿菌產脂肪酶活性最高，嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種次之，而產蛋白酶活性最高的是德氏乳桿菌保加利亞亞種，嗜熱鏈球菌與乳酸乳桿菌次之。乳酸菌產生的脂肪酶和蛋白酶活性變化與菌株自溶程度有密切的關系，自溶度越大的菌株產酶活性到達峰值的時間越短。所以在乳酸菌發酵劑的選擇過程中，應根據所需目的的不同，針對各種目標菌群進行分析，找到最適合的培養條件，或者通過添加自溶度不同的菌株來加速或降低發酵劑的自溶程度，從而達到生產所需的目的，使之成為適合工業生產的優良發酵劑。

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Lipase and protease activities and autolysis properties of lactic acid bacteria

SUN Jie1，2，LV Jia－ping1，*，LIU Lu1，ZHANG Shu－wen1
（1.Institute of Agro－food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Agricultural Product Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China；2.Chinese Academy of Agricultural Engineering，Beijing 100125，China）

The autolysis properties of lactic acid bacteria are crucial for their applications as dairy starters.The autolysis rate of S.salivarius ssp.，L.delbrueckii ssp.Bulgaricus and L.lactis ssp.Lactis were determined under various conditions of incubated temperature and pH values，as these factors were closely related to cell viability and flavor development in the products.Autolysis increased when temperature and pH values were rising in a certain range.Over the range，higher or lower temperature and pH value would inhibit the autolysis rate of strains. Lipase and protease activities were closely related to the sort of strains.Time of reaching the highest activities for lipase and protease depended on the autolytic degree of strains.All L.lactis ssp.Lactis strains showed higher lipase activities，and protease activities in L.delbrueckii ssp.Bulgaricus were mostly higher than other strains.These properties should be considered when commercial starters were selected.

lactic acid bacteria；autolysis；lipase；protease

TS201.3

A

1002－0306（2010）12－0164－04

乳酸菌以其優良的發酵特性及益生功能在化工及食品工業中的地位毋庸置疑，近年來大量文獻報道了通過優化發酵工藝來有效增加乳酸菌活菌數，此外通過基因調控等方式改善乳酸菌在生產過程及產品中的生長狀態也成為當前研究熱點之一。乳酸菌自溶（Autolysis）是指在一定的條件下，菌體細胞自身釋放某些酶類水解細胞壁肽聚糖的網絡結構而導致其裂解，胞內物質向周圍環境釋放的過程［1］，這些酶類被稱之為自溶酶（autolysin）。關于細菌自溶的確切機制尚不清楚，但可以肯定的是，自溶是細胞在生長過程中不可或缺的正?，F象［2］。乳酸菌的自溶特性對發酵乳制品品質影響較大，以干酪為例，發酵劑乳酸菌的快速自溶不僅可縮短成熟周期、降低生產成本，而且菌體自溶后釋放的多種蛋白酶類和脂肪酶，又決定著干酪風味及感官特性［3－5］。同樣在酸奶制作中，發酵劑菌株的自溶不但影響酸奶風味和感官品質，也會造成活菌數下降、酸奶保健功能降低等負面影響。但適度的自溶又可減少酸奶后酸化及改善風味。所以，研究乳酸菌自溶特性及菌株在自溶期間釋放的主要酶活性變化規律，對改進干酪和酸奶品質具有重要的指導意義。本文以發酵乳制品生產中最常用的三種乳酸菌為研究對象，通過比較不同菌株的自溶規律及其菌體釋放的蛋白酶與脂肪酶酶活性變化，初步探討自溶程度的影響因素及菌體脂肪酶與蛋白酶活性變化與自溶度的相關關系。

2009－11－23 *通訊聯系人

孫潔（1980－），女，博士，研究方向：食品微生物與乳品加工。

國家科技部“十一五”奶業產業化支撐計劃（2006BAD04A07，2006BAD04A10）。