游離脂肪酸對DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響*

龔東平，胡耀池，張紅漫，陳園力

1(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京，210009)2(南京工業(yè)大學理學院，江蘇南京，210009)

游離脂肪酸對DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響*

龔東平1，胡耀池1，張紅漫2，陳園力1

1(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京，210009)2(南京工業(yè)大學理學院，江蘇南京，210009)

針對游離脂肪酸(FFA)對裂殖弧菌DHA油脂的氧化穩(wěn)定性進行了研究。通過向純化后的DHA油脂中加入短、中、長3種不同碳鏈的FFA，采用Schaal烘箱法加速氧化，以過氧化值POV(一級氧化指標)和硫代巴比妥酸反應物TBRAS(二級氧化指標)表征油脂氧化情況。結(jié)果表明:加入FFA后DHA油脂的氧化穩(wěn)定性降低，由此得出游離脂肪酸對DHA油脂氧化有促進作用;經(jīng)加入烷烴作對照，初步證實了FFA的促氧化作用與其羧基有關(guān)。

DHA油脂，游離脂肪酸，氧化穩(wěn)定性，促氧化

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種重要的n-3長鏈多不飽和脂肪酸，俗稱腦黃金，具有增強記憶，促進智力和視力發(fā)育，降低血脂，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功效，因此在嬰幼兒配方食品及保健品中添加DHA越來越受到重視［1－2］。但因DHA油脂具有高不飽和度，生產(chǎn)應用中極易氧化產(chǎn)生異腥味，影響食品的感官品質(zhì)及營養(yǎng)價值［3］。目前DHA油脂的抗氧化研究多集中在天然抗氧化劑的篩選及其微膠囊包埋方面上，對DHA油脂中的微組分對其氧化穩(wěn)定性的影響研究較少。精煉后的可食用油脂中的微組分(亦即非甘三酯)通常包含色素(類胡蘿卜素及葉綠素)、酚類、游離脂肪酸(FFA)、磷脂、過氧化物、甾醇、甘一(二)酯中的幾種，占油脂的5%左右，這些微組分對油脂具有抗氧化或促氧化效應［4］。精煉后的DHA油脂中的酸價AV在0.1～0.5 mg/g，而FFA的存在對DHA精油的氧化穩(wěn)定性的影響仍未知。本研究采用多層填料柱層析柱去除DHA油脂中的微組分，然后外加FFA，采用Schaal烘箱法加速氧化，通過測定過氧化值POV和硫代巴比妥酸反應物TBRAS，探討了FFA的種類及添加量對DHA油脂的氧化穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精煉DHA油脂:不添加任何抗氧化劑，江蘇天凱生物科技有限公司;粗孔硅膠:100～200目，青島海洋化工廠;活性炭，南京佳力活性炭廠;硅藻土545，阿拉丁;羊脂酸、豆蔻酸、硬脂酸、正辛烷均為GC級;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GZX-9140電熱鼓風干燥，上海博迅實業(yè)有限公司;Lamada-25紫外/可見分光光度計，PerkinElmer公司;恒溫水浴鍋;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 多層填料柱層析去除DHA油脂中的微組分

本研究采用4層填料層析柱去除DHA油脂中的微組分［5］。在一根層析柱(4cm i.d×60cm)中依次填入活化后的硅膠50 g，m(活性碳)∶m(硅藻土545)=1∶2混合物45 g，m(硅藻土545)∶m(蔗糖)=1∶2混合物45 g，活化硅膠50 g。4層填料均浸泡在正己烷中采用濕法裝柱，并通過三通閥連接雙聯(lián)球壓實。走樣前用正己烷反復洗柱直至洗脫液的過氧化值為0。取一定質(zhì)量的DHA油脂溶于等體積的正己烷中，注入層析柱后純氮加壓(0.1 MPa)收集洗脫液直至洗脫液滴在濾紙上無油跡。洗脫液30℃下真空旋轉(zhuǎn)回收正己烷，痕量正己烷通過鼓入純氮去除。所得純化油樣置于－80℃中保存待分析。

1.3.2 DHA油脂的微組分分析

經(jīng)柱層析純化后的 DHA油脂，按照 GB/T5009.37－2003測定DHA油脂的過氧化值(POV)及酸價(AV);按照GB/T 5009.181－2003測定DHA油脂的硫代巴比妥酸反應物(TBRAS)，結(jié)果以丙二醛(MA)計，μg MA/g;采用甲醇萃取油脂中的酚類物質(zhì)并通過福林酚比色法［7］測定DHA油脂中的總酚的含量，結(jié)果以沒食子酸(GAE)計，μg GAE/g;按照GB/T 5537－2008測定DHA油脂中的總磷脂含量;將DHA油脂溶于6倍體積的正己烷后，采用全波長掃描法［6］通過吸光值來表征油脂的色素含量。

1.3.3 DHA油脂的加速氧化實驗

用純化后的DHA油脂分別配制含羊脂酸(C8:0)、豆蔻酸(C14:0)、硬脂酸(C18:0)的油樣，每種油樣中FFA的添加量均設置0.2%、0.4%、0.8%3個水平，并以空白油樣做對照，混勻后各取40 g置入100mL燒杯中，蓋上表面皿，采用 Schaal烘箱法［8］于(40±1)℃下避光加速氧化。

1.3.4 DHA油脂氧化程度的評價方法

脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)生氫過氧化物ROOH，繼續(xù)氧化ROOH會分解成許多小分子混合物，如醛、酮、烴、醇等［9］。本研究通過測定過氧化值POV表征油脂一級氧化情況;采用TBRAS法測定油脂中的丙二醛(MA)表征其二級氧化情況;同時測定酸價AV表征DHA油脂中酸性產(chǎn)物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱層析純化前后DHA油脂的微組分分析

多層填料柱層析法是一種純化油脂得到甘三酯的方法，采用此法去除DHA油脂中的微組分后其物化性質(zhì)變化如表1所示。從表1可知，柱層析后DHA油脂的POV降低90%，TBARS降低94%，酸價AV降為0，表明多層填料層析柱對DHA油脂的氧化產(chǎn)物及游離脂肪酸有很好的吸附作用;因本研究所用DHA油樣經(jīng)過高度精煉，故磷脂未檢出;具有抗氧化作用的酚類物質(zhì)，由柱層析前的(5.78±0.41)μg GAE/g降低為(1.15±0.099)μg GAE/g。因類胡蘿卜素的主要吸收波長在430～460 nm，葉綠素及其衍生物的吸收波長在550～710 nm［6］，紫外全波長掃描顯示(圖1):DHA油脂的色素主要為類胡蘿卜素;經(jīng)過柱層析分離后，類胡蘿卜素得以有效去除，430 nm處DHA油脂的吸光值由層析前的0.330降至0.041(表1)，故純化后的油脂清澈并接近無色。本研究通過柱層析純化DHA油脂，消除了其他微組分對DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響。

表1 柱層析純化前后DHA油脂的物化性質(zhì)

圖1 純化前后DHA油脂/正己烷(體積比1∶6)混合液全波長掃描圖

2.2 FFA對DHA油脂過氧化值POV的影響

脂質(zhì)氧化的初期，一級氧化產(chǎn)物ROOH的生成速率遠遠大于其分解速率，因而可以通過測定POV來評價油脂的氧化程度［9］。在純化后的DHA油脂中添加3種不同碳鏈的FFA后，其POV在40℃加速氧化下的變化趨勢如圖2所示。

圖2 FFA對DHA油脂的過氧化值POV影響

從圖2(A)可知，添加了羊脂酸(C8∶0)的DHA油脂的POV比對照要高(P＜0.05)，并且隨著羊脂酸添加量的增加，POV也隨之顯著增加(P＜0.05)，由此得出羊脂酸對DHA油脂有促氧化作用;圖2(B)中，添加了豆蔻酸(C14:0)的DHA油脂出現(xiàn)了與圖2(A)同樣的POV上升趨勢，亦即豆蔻酸同樣對DHA油脂有促氧化作用;圖2(C)中，添加了0.2%硬脂酸(C18∶0)的DHA油脂的POV變化與對照并無顯著性差異(P＞0.05)，并且隨著硬脂酸(C18∶0)添加量的增加，POV并沒隨之明顯增加(P＞0.05);但與對照相比，添加了高水平硬脂酸(0.8%)的DHA油脂其POV明顯增高(P＜0.05)，由此得出，長碳鏈的硬脂酸(C18∶0)對DHA油脂也有促氧化作用，但在低水平下，其促氧化作用并不明顯;從圖2(D)中POV的變化可知，同一添加量下(0.8%)，低碳鏈的羊脂酸(C8∶0)對DHA油脂的促氧化作用最強，中碳鏈的豆蔻酸(C14:0)促氧化作用居中，長碳鏈的硬脂酸(C18∶0)最弱(P＜0.05)。原因可能在于相同的質(zhì)量添加分數(shù)下，碳鏈越短，分子質(zhì)量越小，所加入的FFA分子數(shù)越多，因而促氧化作用越強。

2.3 FFA對DHA油脂TBARS的影響

從圖3可以看出，隨著加速氧化時間的延長，DHA油脂的TBARS值在不斷升高，說明DHA油脂中的二級氧化產(chǎn)物-醛類物質(zhì)在不斷增加。

圖3 FFA對DHA油脂TBARS的影響

圖3(A)中，添加了不同濃度的羊脂酸(C8∶0)的DHA油脂與空白比較，TBARS值均有所上升(P＜0.05)，并且TBARS值隨著羊脂酸(C8∶0)的添加量的增加而上升(P＜0.05)，此變化趨勢與圖1(A)中的POV變化趨勢相似;圖3(B)顯示，相同的添加量下(0.8%)，F(xiàn)FA碳鏈越短，所對應的DHA油脂中的TBARS越高(P＜0.05)，與圖1(D)的POV變化趨勢亦相似;TBARS作為油脂的二級氧化指標，進一步證明了FFA分子對DHA油脂有促氧化作用。

2.4 FFA對DHA油脂的酸價AV的影響

測定油脂的酸價AV實際上是檢測油脂中的FFA及酸性氧化產(chǎn)物的多少。從圖4中可以看出，40℃下加速氧化時空白油樣的酸價有微弱的增加，而添加了3種FFA的DHA油脂的酸價并沒有明顯的變化(P＞0.05)，說明40℃加速氧化條件下，所添加的FFA并沒有促使DHA油脂中的酯鍵水解生成更多的游離脂肪酸;同時也說明添加FFA后，DHA油脂氧化生成二級酸性氧化產(chǎn)物的過程，可能受到了外加的FFA的抑制作用或者反應處于動態(tài)平衡中。

圖4 FFA對DHA油脂酸價AV的影響

2.5 正辛烷與羊脂酸對DHA油脂氧化穩(wěn)定性的影響

圖5 正辛烷與羊脂酸對DHA油脂的POV及TBARS的影響

為了驗證FFA對DHA油脂的促氧作用是否與其極性的—COOH基團有關(guān)，本研究中，將與羊脂酸具有相同碳原子數(shù)的正辛烷與羊脂酸按同一摩爾分數(shù)(0.07mmol/g)加入到純化后的DHA油脂中，于40℃下進行加速氧化。從圖5(A)可知，加有正辛烷油樣的POV與空白油樣并無顯著差異 (P＞0.05)，而加有羊脂酸油樣的POV明顯高于空白油樣(P＜0.05);與此相同，圖5(B)中，加有正辛烷油樣的TBARS與空白油樣亦無顯著差異 (P＞0.05)，而加有羊脂酸油樣的TBARS同樣明顯高于空白油樣(P＜0.05);說明不含-COOH基團的正辛烷并不能促進DHA油脂的氫過氧化物ROOH及醛類物質(zhì)的形成，相反羊脂酸加速DHA油脂氧化的作用明顯，從而驗證了FFA加速DHA油脂氧化與其極性的—COOH基團有關(guān)。

3 結(jié)論

去除DHA油脂中的其他微組分后，通過單加FFA發(fā)現(xiàn)，不論其碳鏈長短，在一定的添加水平下，都對DHA油脂有促氧化作用，其促氧機理可能有以下2個方面:(1)FFA分子的極性—COOH基團能夠催化脂質(zhì)氫過氧化物ROOH分解生成自由基，后者可加速脂質(zhì)自動氧化的鏈式反應［10］;(2)FFA分子因—COOH呈極性，在高水平下，同甘一(二)酯、磷脂等極性組分一樣，易于富集在油脂表層并降低其表面張力，通過吸收空氣中的氧分子從而加速油脂氧化［4］。

因此，在DHA油脂的精煉過程中，要盡量減少FFA的含量，避免能夠促進中性脂質(zhì)水解生成FFA的因素;對精煉后含有微量FFA的DHA油脂，要加入能夠鈍化—COOH催化活性的抗氧化劑，相關(guān)的研究工作還將繼續(xù)。

［1］Horrocks L A，Yeo Y K.Health benefits of docosahexaenoic acid(DHA)［J］.Pharmacol Res，1999，40:211－215.

［2］Connor WE.Importance of n-3 fatty acids in health and disease［J］.Am J Clin Nutr，2000，71:171S－175S.

［3］朱麗娜，張志國，張敏，等.DHA的生理功能及其在食品中的穩(wěn)定性［J］.中國乳品工業(yè)，2009，37(2):45－48.

［4］Akoh C K，Min D B.Food lipids:chemistry，nutrition，and biotechnology［M］.Florida:CRC Press，2008:449－453.

［5］Kulas E，Ackman RG.Protection of α-tocopherol in nonpurified and purified fish oil［J］.J Am Oil Chem Soc，2001，78:197－203.

［6］Abuzaytoun R，Shahidi F.Oxidative stability of flax and hemp oils［J］.J Am Oil Chem Soc，2006，83:855－861.

［7］Abuzaytoun R，Shahidi F.Oxidative stability of algal oils as affected by their minor components［J］.J Agric Food Chem，2006，54(21):8 253－8 260.

［8］朱振寶，田賓，易建華.金銀花不同提取物的油脂抗氧化效果研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(2):69－72.

［9］李桂華油料油脂檢驗與分析［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006:74－80.

［10］Miyashita K，Takagi T.Study on the oxidative rate and prooxidantactivity of free fatty acids［J］.J Am Oil Chem Soc，1986，63(10):1 380－1 384.

Effect of Free Fatty Acid on the Oxidative Stability of DHA Oil

Gong Dong-ping1，Hu Yao-chi1，Zhang Hong-man2，Chen Yuan-li1
1(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing 210009，China)2(College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

The effect of free fatty acid(FFA)on the oxidative stability of DHA oil produced by Schizochytrium sp.Was studied.The oxidation of purified DHA oils added with three kinds of FFA were monitored by measuring peroxide value(POV，index of primary oxidation products)and thiobarbituric acid reactive substances(TBARS，index of secondary oxidation products)under Schaal oven test condition.Results showed that the oxidative stability of purified DHA oils was decreased by adding FFA.With the control of alkane，the pro－oxidant effect of FFA due to its carboxyl groups was initially confirmed.

DHA oil，free fatty acid，oxidative stability，prooxidant

碩士研究生(張紅漫為通訊作者)。

*國家自然科學基金重點項目(No.20936002);國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(Nos.2007CB707805，2009CB724700);江蘇省六大人才高峰項目(2008);江蘇省高校科研成果產(chǎn)業(yè)化推進項目(2009)

2010－07－19，改回日期:2010－09－15