甘精胰島素對糖尿病大鼠主動脈結構及TGF-β1、III型膠原表達的影響

金秀平，谷 巍

（華北煤炭醫學院附屬醫院 內分泌科，河北 唐山 063000）

糖尿病引起動脈粥樣硬化（atherosclerosis AS）發病早、發病率高、病情進展快，是糖尿病主要死亡原因。本研究旨在觀察甘精胰島素對糖尿病大鼠主動脈結構及TGF-β1、III型膠原表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性Wistar大鼠50只，體重180～220克（華北煤炭醫學院動物中心），STZ（美國sigma公司），甘精胰島素（長秀霖），Masson特染試劑盒（福州邁新生物技術公司），免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 50只大鼠隨機分對照組10只、實驗組40只。實驗組造模前禁食12 h，按65 mg/kg腹腔注射STZ，對照組注射相應體積0.1mol/L無菌檸檬酸緩沖液。注射后分別于3 d、1周同一時間剪尾測血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病大鼠模型成立。造模過程中2只死亡。將造模成功38只隨機分糖尿病組19只、胰島素組19只。糖尿病組不給任何治療，常規喂養。胰島素組給予甘精胰島素1.5 U/kg/d，根據血糖監測調整胰島素劑量，維持血糖在8mmol/L左右。

1.2.3 生化指標的檢測 各組分別于造模前，造模后1周、治療后1、2、4周測體重，剪尾測血糖。治療后4周日立全自動生化分析儀酶法測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C。

1.2.4 免疫組化測定 采用免疫組化試劑盒，SABC法，免疫組化圖象分析經標準灰度校正，隨機取5個視野，同等條件下測TGF-β1及III型膠原平均積分光密度值IDP。

2 結果

2.1 大鼠體重及各項實驗室指標改變

造模前各組體重、血糖、血脂無明顯差異（P＞0.05）。造模后1周比對照組血糖明顯升高（P＜0.01），體重明顯下降（P＜0.01），治療后1周胰島素組比糖尿病組，血糖明顯下降（P＜0.01），體重明顯升高（P＜0.01），治療后4周糖尿病組比對照組血脂明顯增高（P＜0.05），胰島素組比糖尿病組血脂明顯下降（P＜0.05）。結果見表1-3。

表1 各組大鼠不同時期體重變化比較（g，±s）

表1 各組大鼠不同時期體重變化比較（g，±s）

注：1）與對照組相比，P＜0.01；2）與模型組相比，P ＜0.01；3）同組相比，P ＜0.05

體重 對照組 模型組 胰島素組造模前 202.54±13.42 204.41±9.80 205.91±10.67治療前 258.36±17.56 182.14±12.201） 193.33±22.961）治療后1周 288.60±27.92 199.46±7.821） 231.61±24.911，2）治療后2周 335.72±27.83 211.00±8.841） 257.71±22.801，2）治療后 4周 376.00±25.233） 210.23±11.421） 304.00±25.413）

表2 各組大鼠不同時期血糖情況變化比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠不同時期血糖情況變化比較（±s，mmol/L）

注：1）與對照組相比，P＜0.01；2）與模型組相比，P ＜0.01

血糖 對照組 模型組 胰島素組造模前 6.62±0.47 6.61±0.76 6.62±0.67治療前 6.18±0.47 28.27±4.191） 30.91±1.951）治療后 1周 6.51±1.22 31.07±2.981） 16.15±7.801，2）治療后2周 6.56±0.77 32.04±1.541） 10.34±7.252）治療后4周 6.32±0.80 32.18±1.331） 6.91±3.582）

表3 各組大鼠血脂情況比較（±s，mmol/L）

表3 各組大鼠血脂情況比較（±s，mmol/L）

注：1）與對照組比，P ＜0.05；2）與糖尿病組比，P ＜0.05

組別 數量 TC TG HDLC LDLC對照組 10 0.43±0.05 0.22±0.05 0.44±0.01 0.08±0.03糖尿病組 19 1.73±0.541） 1.21±0.381） 0.22±0.061） 0.49±0.131）胰島素組 19 0.45±0.042） 0.50±0.152） 0.43±0.092） 0.06±0.032）

2.2 主動脈光鏡觀察

HE染色見圖1，Masson染色見圖2。

對照組：內膜平坦，內皮細胞扁平，中層平滑肌細胞整齊排列，平滑肌細胞間有少量膠原纖維。糖尿病組：內膜增厚，局部有內皮細胞脫落，中層平滑肌排列紊亂，可見少量體積大、胞漿空的泡沫細胞，膠原纖維增多。胰島素組：內膜較厚，內皮細胞脫落較少，中層平滑肌細胞平行排列，膠原增多不明顯。采用計算機圖像分析系統進行半定量分析測內膜厚度及中膜厚度（表4）：糖尿病組比對照組內膜厚度及內膜/中膜厚度明顯升高（P＜0.05），胰島素組比糖尿病組明顯降低（P＜0.05）。同時，比較各組膠原面積占統計總面積百分比（表5）：糖尿病組比對照組膠原面積明顯升高（P＜0.05），胰島素組比糖尿病組明顯降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠主動脈內膜厚度及中膜厚度情況比較（±s）

表4 各組大鼠主動脈內膜厚度及中膜厚度情況比較（±s）

注：1）與對照組比，P ＜0.05；2）與糖尿病組比，P ＜0.05

組別 數量 IMT（μm） IMT/IFT（%）對照組 10 4.56±1.01 3.21±1.05糖尿病組 19 21.61±3.611） 15.25±1.061）胰島素組 19 12.61±1.611，2） 6.84±1.671，2）

表5 各組大鼠主動脈膠原面積占統計總面積百分比（±s）

注：1）與對照組比，P ＜0.05；2）與糖尿病組比，P ＜0.05;

組別 數量 膠原面積/統計血管總面積（%）對照組 10 2.46±1.09糖尿病組 19 38.19±6.561）胰島素組 19 18.98±5.611，2）

2.3 主動脈透射電鏡觀察

對照組：內皮細胞扁平，細胞間可見完整緊密連接，內彈性膜完整。糖尿病組：內膜明顯增厚，內皮細胞脫落，細胞核分裂，內彈性膜不連貫。胰島素組：內皮細胞較完整，表面粗糙，細胞間可見細胞連接結構，內彈性膜完整，結果見圖3。

2.4 免疫組化結果：TGF-β1及III型膠原的表達

陽性結果（TGF-β1表達在細胞漿和細胞間，III型膠原表達在平滑肌細胞漿和細胞間）顯棕黃色，正常大鼠組織切片作為陰性對照。TGF-β1：糖尿病組（0.0987±0.0198）比對照組（0.0179±0.0018）表達明顯升高（P＜0.05），胰島素組（0.0198±0.0019）比糖尿病組表達明顯降低（P ＜0.05）；III型膠原：糖尿病組（0.0457±0.0128） 比對照組（0.0138±0.0020）表達明顯升高（P＜0.05），胰島素組（0.0130±0.0029）比糖尿病組表達明顯降低（P＜0.05），見圖 4、圖 5。

圖1 主動脈HE染色（×400）

圖2 主動脈Masson染色（×400）

圖3 主動脈電鏡

圖4 各組主動脈免疫組化TGF-β1表達情況

圖5 各組主動脈免疫組化III型膠原表達情況

3 討論

AS是糖尿病大血管病變病理基礎[1]，動脈平滑肌細胞增生是AS重要組成部分，內膜平滑肌灶性增生是AS最早可識別形態學變化[2]。研究顯示，STZ造模4周后，透射電鏡觀察到糖尿病組大鼠主動脈內皮細胞大面積脫落，中膜淺層平滑肌細胞明顯增生活躍并向內膜層遷移，平滑肌周圍有大量膠原纖維增生，提示糖尿病主動脈結構發生了病理改變。非酶糖化蛋白終末產物（AGE）導致膠原的絞連，基底膜增厚，并可與特異AGE受體結合，促進某些細胞因子釋放，如高血糖與AGE均可刺激TGF-β1合成[3]。TGF-β1是一種多功能細胞因子，主要作用是調節細胞外基質（ECM）形成，使成纖維細胞合成膠原、層粘連蛋白等[4]。研究顯示，TGF-β1在糖尿病大鼠主動脈中表達明顯增高，血管平滑肌細胞間III型膠原表達也增高，表明高血糖通過TGF-β1促使ECM增生，進而促進中層平滑肌細胞增生并向內膜遷移。

胰島素能降低血糖，抑制脂肪分解，美國學者研究還發現，胰島素具有抗炎及抗動脈粥樣硬化作用[5]。甘精胰島素（insulin glargin〔GlyA21，Arg-B31，ArgB32〕）是超長效胰島素類似物，目前已應用于臨床。它是利用重組DNA技術生產的生物合成人胰島素類似物。本研究中，糖尿病大鼠注射甘精胰島素后，主動脈病理改變明顯減輕，血糖、血脂下降，血管壁TGF-β1及collagen III表達明顯降低，提示甘精胰島素可能通過降低血糖、血脂，下調TGF-β1及collagen III表達，從而抑制主動脈內ECM增生，改善糖尿病大血管病變，但具體作用機制有待進一步研究。

[1]SANZ PARIS A,GAMBOA RA,USON JP,CELAYA PEREZ S.New dietetic recommendations in diabetes mellitus:the implications in enteral nutrition.Nutr Hosp,1995,10(3):143-151

[2]STOUT RW.Hyperinsulinemia and atherosclerosis.Diabetes,1996 Jul;45 Suppl 3;S45-6

[3]HAO FENG,YU Jinde.High glucose enhance expression of matrix metalloproteinase-2 in smooth muscle cells[J].Acta Pharmacol Sin,2003,24(6):534–538

[4]ZIYADEL FN,SHERMA K,ENICKSEN M.et al.Stimulation of collagen game expression and protein synthesis in murine mesangial cells by acti vation of transforming growth factor- B1 JClinlnvest 1994,93:536.

[5]ROSS R,et al.The responsets injury and atherosclerosis:the rote of endothelium and smooth muscle.Atheroscleresis 1987,8(6):69.