脂肪干細胞向軟骨細胞誘導分化能力的研究

李寶軍 ，鄧展生 ，高嵩濤 ，郭曉檸 ，張勝利 ，沈民仁

（1.湖南省第二人民醫(yī)院 骨關節(jié)外科，湖南 長沙 410007；2.中南大學湘雅醫(yī)院 脊柱外科，湖南 長沙410008；3.河南省腫瘤醫(yī)院 骨科，河南 鄭州 450008）

關節(jié)軟骨的自我修復能力十分有限，臨床上由于創(chuàng)傷、腫瘤、感染以及退行性變等原因導致的關節(jié)軟骨損傷和缺損尚無理想的修復方法[1]，為矯形關節(jié)外科亟需解決的難題。組織工程學的興起和不斷發(fā)展，為利用組織工程化軟骨進行軟骨缺損修復帶來了希望。目前，有關軟骨組織工程種子細胞的研究以軟骨細胞和骨髓間充質干細胞為主，隨著組織工程學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)脂肪組織也是多能干細胞的來源之一，而脂肪干細胞（ADSC）和骨髓干細胞（BMSC）一樣，具有多向分化潛能[2]，且相對于骨髓基質干細胞具有來源廣泛、易于獲得、對機體影響小、并且可獲得大量細胞等優(yōu)點[3]。本實驗以大鼠作為研究對象，探討了脂肪干細胞體外提取并定向分化為軟骨細胞的能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常成年健康SD大鼠，雌雄不限，質量80～120 g（由中南大學動物試驗部提供，許可證號：滬SCXK2003-0003）。新生牛血清、低糖DMEM、高糖DMEM（Gibco，American）；TGF-β1（Cellcience，Australia）；胰島素，轉鐵蛋白，地塞米松和維生素C、胰酶、膠原酶 I型（Sigma，American）；抗 II型膠原多克隆山羊抗體（Cellcience，Australia），生物素化抗山羊IGg和DAB顯色試劑盒（北京中山金橋公司）；aggrecan兔抗大鼠多克隆抗體（Santa Cruz，Australia），辣根酶標記抗兔IGg和FITC標記抗兔IGg（北京中山金橋公司）；組織細胞總RNA提取試劑Trizol（MRC，American）、RT反應試劑盒、PCR 反應試劑盒（MBI，American）。

1.2 方法

1.2.1 ADSC的分離、培養(yǎng) SD大鼠（80～120 g），斷頸處死；75%的酒精浸泡5min；無菌條件下取雙側腹股溝脂肪，PBS充分沖洗，剪碎至1mm3大小碎塊；予0.075%I型膠原酶在37℃振蕩消化40～50 min；等量的含10%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，于200目濾網(wǎng)過濾以去除大塊未消化脂肪組織，1 300 r/min離心10min，去上清；PBS重懸細胞洗滌，200目濾網(wǎng)再過濾，1 300 r/min離心10 min，去上清；含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100μ/mL，鏈霉素100μg/mL）重懸細胞，取樣行臺盼藍染色拒染，計算細胞數(shù)量和活力，以106/100mm2培養(yǎng)板底面積種植活力細胞，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng)。經(jīng)2～3d換液1次，細胞增殖、鋪滿至培養(yǎng)瓶底約80%，接近融合狀態(tài)時，予0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 ADSC的成軟骨誘導 收集傳5代ADSC，含10%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調整密度為1.5×107/mL，予10μL/滴在24孔培養(yǎng)板內。進行“微團”培養(yǎng)后1 d，換用含1%新生牛血清、10 ng/mL的 TGF-β1、6.25μg/mL的胰島素、6.25μg/mL的轉鐵蛋白、10-7M的地塞米松、50 μg/mL的維生素C的高糖DMEM作為特定培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)。

1.2.3 免疫組化染色和免疫熒光 在誘導7、14 d后，取細胞玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定，應用II型膠原蛋白免疫組化染色和aggrecan免疫熒光檢測。①II型膠原蛋白免疫細胞化學染色：細胞玻片依次經(jīng)3%H2O2滅活內源性過氧化氫酶15 min，PBS沖洗，10%正常兔血清封閉非特異性結合30 min，滴加1∶100的抗II型膠原多克隆山羊抗體濕盒內4℃過夜，PBS沖洗，滴加1∶100生物素標記的抗山羊IGg孵育15min，PBS沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素孵育15min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。②Aggrecan細胞免疫熒光：細胞玻片依次經(jīng)3%H2O2滅活內源性過氧化氫酶15min，PBS沖洗，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10～15min，傾去血清，勿洗，滴加1∶100稀釋的aggrecan兔抗大鼠多克隆一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加1：100稀釋的FITC標記抗兔Ig G二抗，37℃孵育30～60min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察、拍照記錄，50%甘油封片保存。

1.2.4 RT-PCR檢測 在誘導 0、2和 4周后，RT-PCR檢測ADSC前II型膠原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表達情況。分別采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，RT試劑盒合成cDNA。采用Primer Premier 5.0設計引物，并經(jīng)GeneBank驗證。引物序列為：β-actin（上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'，下游 5'-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3’；201 bp）；Col2a1（上游 5'-CAAGTCGCTGAACAACCAGA-3'，下游 5'-GCCCTCATCTCCACATCATT-3’；320 bp）；Agc1（上游 5'-TAGAGAAGAAGAGGGGTTAGG-3'，下游 5'-AGCAGTAGGAGCCAGGGTTAT-3'；322 bp）；Sox9（上游 5'-CGGAACAGACTCACATCTCTCCTAATGC-3’，下游 5’-CGAAGGTCTCAATGTTGGAGATGACGTC-3’；292 bp）。根據(jù)設計引物進行PCR擴增合成DNA，反應條件：Col2a1（預變性 94℃5s；變性 94℃ 45 s，退火56℃ 45 s，延伸72℃ 50 s，循環(huán)30次；再延伸72℃7 min）；Agc1（預變性 94℃5min；變性 94℃ 45 s，退火 54℃ 45 s，延伸72℃ 1min，循環(huán) 28次；再延伸 72℃ 7min）；Sox9（預變性 94℃5min；變性94℃ 45 s，退火 54℃ 45 s，延伸 72℃1min，循環(huán)32次；再延伸72℃ 7min）。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中進行鑒定。

2 結果

2.1 ADSC誘導后形態(tài)特征

5代ADSC形態(tài)均一，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時可呈漩渦樣生長，細胞之間可見零星脂滴存在（圖1）。誘導2 d后，細胞形態(tài)由梭型漸變?yōu)槿切巍⒍嘟切巍⒍趟笮危毎鲋趁黠@減緩，呈聚集生長，基質分泌，形成有結節(jié)（圖2）。10 d左右結節(jié)呈類軟骨樣外觀，不再增大。

圖1 第5代ADSC（×100）

圖2 第5代ADSC（×100）誘導后48 h

2.2 ADSC誘導后免疫組化染色和免疫熒光

ADSC誘導7 d后，聚集結節(jié)Ⅱ型膠原免疫組化染色見胞膜、胞外基質呈棕黃色異染陽性（圖3）；14d后聚集形成的結節(jié)呈強陽性表達，可在小結節(jié)看到均勻密布的胞膜胞外基質陽性表達（圖4）；未誘導組細胞Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色陰性。

ADSC誘導后7 d的aggrecan細胞免疫熒光檢測，可見其胞漿、胞膜和胞外基質有綠色熒光表達，尤以聚集結節(jié)表達明顯（圖5）；14 d后可見高密度細胞層面和周邊的網(wǎng)狀物呈綠色熒光表達（圖6）；未誘導組細胞則未見明確綠色熒光表達。

圖3 ADSC誘導7 dⅡ型膠原染色（×600）

圖4 ADSC誘導14 dⅡ型膠原染色（×600）

圖5 ADSC誘導7daggrecan熒光（×600）

圖6 ADSC誘導14 d aggrecan熒光（×600）

2.3 RT-PCR檢測ADSC誘導后Col2al、Agc1和Sox9的m RNA的表達情況

對微團培養(yǎng)的ADSC在誘導0周（即未誘導）、2周和4周，采用RT-PCR從基因水平檢測其Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達情況，可見總RNA表達完整（圖7），內參照β-actin均在201 bp條帶表達；在未誘導組，未見 Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達條帶出現(xiàn)。在誘導2、4周組均可見：Col2al的mRNA在320 bp條帶表達；Agc1的mRNA在322 bp條帶表達；Sox9的mRNA在292 bp條帶表達（圖 8，9，10）。比較誘導后 2，4周2組目的條帶和內參灰度值之比，應用兩樣本t檢驗統(tǒng)計學方法比較，顯示誘導后 2，4周時間點 Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達水平，P值均＞0.05，無顯著統(tǒng)計學差異（附表）。

附表脂肪間充質干細胞誘導后2，4周Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達水平（±s）

附表脂肪間充質干細胞誘導后2，4周Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達水平（±s）

誘導后時間點樣本數(shù)n Sox9/β-actin mRNA灰度值比2周5 0.737±0.033 0.766±0.027 0.781±0.022 4周5 0.745±0.037 0.788±0.015 0.796±0.021 Col2al/β-actin mRNA灰度值比Agc1/β-actin mRNA灰度值比

圖7 高密度ADSC誘導后總RNA表達

圖8 高密度ADSC誘導后Col2al的mRNA表達電泳

圖9 高密度ADSC誘導后Acg1的mRNA的表達電泳

圖10 高密度ADSC誘導后Sox9的m RNA的表達電泳

3 討論

關節(jié)軟骨損傷和退行性疾病依然是全球范圍內威脅健康的主要問題之一。盡管在手術或非手術措施進行干預治療方面進展很快，但軟骨損傷的修復仍然是十分棘手的問題[4]。軟骨組織工程結合細胞生物學、工程學、材料科學和外科學，旨在重建新的有功能組織，為關節(jié)軟骨的修復奠定基礎，以期能夠獲得最終長期的功能恢復，成為解決軟骨修復難題最有前景的一種途徑[5]。有關軟骨組織工程種子細胞的研究多數(shù)集中于軟骨細胞和骨髓間充質干細胞，而有關ADSC作為軟骨組織工程種子細胞的研究相對少見[3]。既往研究表明，在體外特定的培養(yǎng)基條件下，ADSC可以表達成骨細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞、脂肪細胞和軟骨細胞表型，因而可能會成為穩(wěn)定可靠的種子細胞[6]。

胚胎時期，軟骨的形成是通過中胚層間充質細胞之間以及細胞基質之間的相互作用的調節(jié)而形成的細胞濃縮相來完成的[7]。本試驗采取微團培養(yǎng)的方式進行成軟骨細胞誘導，這種高密度的接種近似于三維培養(yǎng)，有利于細胞之間的相互黏附和信號傳遞[7]，部分地模擬了胚胎時期的高密度細胞聚集生成軟骨的現(xiàn)象[8]。BARRY[9]等認為，間充質干細胞分化為軟骨的條件包括：①三維培養(yǎng)方式；②無血清誘導劑；③加入TGF-β超家族生長因子。血清中包含有許多不確定的生長因子和分化因子，進而可能激發(fā)干細胞的自發(fā)多向分化潛能，而不是向軟骨方向的單向分化。因此，促進干細胞向軟骨分化的理想培養(yǎng)環(huán)境，應該限定于化學組成和無血清或合成血清代用品，如果有必要，可以配備特定的重組細胞因子和生長因子[10]。然而，目前尚無十分理想的無血清培養(yǎng)基或誘導劑能夠同時促進細胞的分化和增殖，而且對配備的細胞生長因子要求高，費用昂貴。參考國外ZUK[6]等有關脂肪間充質干細胞向軟骨細胞分化的培養(yǎng)基條件，本實驗中采用含1%新生牛血清誘導劑。

在軟骨形成過程中，TGF-β1是調節(jié)細胞增殖和分化的關鍵因子。高密度的間充質干細胞的聚集是使其定向軟骨細胞分化的始動步驟，而TGF-β1則起著關鍵的啟動作用[11]。這種始動作用有可能是其通過促使軟骨細胞轉錄因子Sox9的表達，進而促進細胞聚集的發(fā)生[11]。胰島素在體外細胞培養(yǎng)體系中，對于維持細胞的活力，促進有絲分裂、糖原和脂肪酸的合成起著十分重要的作用。有研究表明，胰島素-轉鐵蛋白-硒能夠促進人的軟骨細胞增殖，并減少軟骨細胞的去分化[12]。地塞米松可以激活間充質干細胞上的糖皮質激素受體，促進間充質干細胞向軟骨細胞分化，并抑制其向脂肪細胞的分化。維生素C作為一種輔助的培養(yǎng)基試劑，對于脂肪間充質干細胞成軟骨分化過程中膠原蛋白和蛋白聚糖的合成也有著一定的促進作用。在本實驗特定的誘導培養(yǎng)基條件下，ADSC逐漸由長梭形變化為三角形，多角形和短梭形，表現(xiàn)為軟骨細胞形態(tài)特征。誘導后ADSC增殖遲緩，分析原因可能是：首先，細胞的增殖能力和分化程度是一對矛盾，增殖能力高的細胞必然分化程度低，而分化程度高的細胞必然增殖能力低。在脂肪間充質干細胞向軟骨細胞分化的過程中，實際是向一種高度分化的細胞類型的轉變，其間必然也伴有增殖能力的降低；其次，并非所有的脂肪間充質干細胞在這種特定的培養(yǎng)誘導劑都能夠向軟骨方向分化，不能適合這種誘導環(huán)境的細胞就可能出現(xiàn)凋亡。Ⅱ型膠原蛋白和aggrecan是軟骨細胞最特異的表面標志，因而是檢測軟骨細胞分化形成的最重要指標。通過比較ADSC組和誘導組的不同時間點的Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色和aggrecan熒光檢測，發(fā)現(xiàn)ADSC的表型確實發(fā)生著明顯的變化，表現(xiàn)有軟骨細胞的明顯特征。誘導后的ADSC聚集成結節(jié)的同時，免疫細胞化學和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在高密度的ADSC之間有Ⅱ型膠原蛋白和aggrecan表達，隨后的1周和2周后，這種表達緩慢增強，在胞膜、胞漿和細胞之間強陽性表達。應用RT-PCR技術，本文進一步從基因水平探討了體外ADSC誘導成軟骨過程中Sox9、Agc1和Col2al的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)在誘導后2周、4周，Sox9、Agc1和Col2al的mRNA均有穩(wěn)定地高表達，而在未誘導組（即誘導0周時）并沒有Sox9、Agc1和Col2al mRNA的表達。該項實驗表明，在特定培養(yǎng)基條件下，高密度微團培養(yǎng)的ADSC可以定向軟骨細胞方向分化，并能夠穩(wěn)定表達軟骨細胞特異表型，為進一步構建組織工程化軟骨奠定了基礎。不斷優(yōu)化誘導培養(yǎng)基條件，解決ADSC分化和增殖受限的矛盾，仍然是以后研究的重點。

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