大鼠脂肪干細胞的培養及向神經細胞的定向分化

周向陽 ，鄧永文 ，方 芳，王 飛，宋 濤，方加勝

（1.郴州市第一人民醫院 神經外科，湖南 郴州 423000；2.中南大學湘雅醫院 神經外科，湖南 長沙410000；3.湖南省人民醫院 神經外科，湖南 長沙 410000）

隨著近年來組織工程學的飛速發展，種子細胞的獲得作為組織工程學的第一大要素，已經將重點放在了成體干細胞的研究上，數以千萬計的學者數十年來一直致力于理想干細胞的尋找工作。美國的ZUK等人在2001年提出了脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSC）的概念，將其向骨、軟骨、肌肉和脂肪細胞進行誘導分化的研究也已取得了成功[1]。神經組織包括的細胞種類較復雜且涉及和神經干細胞（NSC），而且鮮有這方面的研究，故ADSC是否真正能夠分化為神經細胞、分化后的細胞在形態和表型上會發生怎樣的變化尚需我們去探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗動物均由中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供的體重180～200 g的健康SD大鼠（雌雄不限）

1.2 主要試劑

DMEM培養基粉劑（美國Gibco Corp.），重組人表皮生長因子（EGF）（PeproTech EC Ltd），重組人堿性成纖維生長因子（bFGF）（PeproTech EC Ltd），B-巰基乙醇（BME）（PeproTech EC Ltd），左旋谷氨酰胺（Invitrogen Corp.），注射用胰島素（Amresco，Inc），二甲基亞砜（DMSO）（Amresco，Inc），左旋多聚賴氨酸（江蘇萬邦生化醫藥有限公司），ABC法免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），兔抗人GFAP多克隆抗體（武漢博士德公司），兔抗人NSE多克隆抗體（武漢博士德公司），小鼠抗人CD44單克隆抗體（武漢博士德公司），CY3標記羊抗小鼠IgG（武漢博士德公司）。

1.3 脂肪組織的取材

取SD大鼠，麻醉滿意后取腹股溝和腹膜后脂肪組織膜后脂肪組織約3 g，置于無菌玻璃小瓶中并用PBS及青、鏈霉素溶液洗3遍。

1.4 ADSC的分離和原代培養

用眼科顯微剪將脂肪組織剪碎為1mm3大小；3 mL 1%Ⅰ型膠原酶加入已剪碎的脂肪組織中，37℃消化1 h，每10min搖晃1次；加入10mL 15%含血清DMEM細胞培養基終止消化并稀釋；不銹鋼篩網（74μm孔徑）過濾含ADSC濁液，濾去組織殘塊；離心管收集濾液，加入紅細胞裂解液2 mL后1 200 r/m離心15 s；離心后濾液分為3層，上層較薄為密度較低的白色泡沫狀脂質層，中層為液體層，底層為細胞層，肉眼可見少許白色絮狀物；移去上層和中層，加入5mL 15%含血清DMEM細胞培養基吹打重懸后，移入50mL塑料無菌細胞培養瓶，相差倒置顯微鏡下觀察原代ADSC形態。

1.5 ADSC的傳代培養

原代ADSC置于5%二氧化碳、37℃細胞培養箱培養，3 d觀察1次并換培養液，觀察時擰緊瓶蓋，放入培養箱時稍松瓶蓋。待細胞生長融合后傳代，超凈工作臺內倒去培養基，加入1mL 0.25%胰蛋白酶傾斜瓶底使其均勻覆蓋瓶底，1min后倒去胰蛋白酶并加入含血清培養基吹打瓶底細胞，相差倒置顯微鏡下觀察，直到大部分細胞回縮成球并與瓶底分離。按1︰2比例將細胞懸液移至另外2個50mL細胞培養瓶，后3～4 d相同方法傳代1次，觀察ADSC形態。

1.6 ADSC表型鑒定干細胞標志物CD44的表達

用免疫熒光法檢測干細胞標志物CD44在ADSC的表達情況，取第3代細胞胰蛋白酶消化制成細胞懸液，適宜密度接種于已用多聚賴氨酸包被的蓋玻片，置于12孔細胞培養板加入含血清培養基培養。24 h后細胞貼壁并伸展完全，行免疫熒光染色：細胞爬片固定破膜后，BSA封閉，加入CD44一抗4℃過夜，Cy3標記的二抗孵育1 h，封片后用短波長藍色激發光觀察，并用數碼相機拍攝高倍鏡下（×200倍）細胞熒光表達情況。

1.7 ADSC的貼壁率的研究

取第3代生長情況較好的ADSC細胞，同上法制成單細胞懸液，以2×105/孔密度接種于24孔細胞培養板。此后，每2 h共12次取其中3孔，移去培養液，將貼壁細胞制成懸液計數數量，按公式：貼壁率（%）=貼壁細胞數/接種細胞數×100%計算三孔貼壁率和平均貼壁率。這些數據可以反映ADSC在接種后24 h內的貼壁情況。

1.8 MTT比色實驗測定ADSC生長曲線

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶的甲贊，經DMSO溶解后可測其光吸收值，利用MTT產物與細胞數成正比的關系檢測細胞生長曲線。取第3代生長情況較好的ADSC細胞，消化吹打制成單細胞懸液，以2×103/孔密度接種于96孔細胞培養板并培養，根據貼壁率結果自接種后24 h，每天取出其中3孔進行MTT比色直到細胞數減少。每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培基上清液，每孔加入150μL DMSO并震蕩10 s，使甲贊充分溶解。選擇492 nm波長處在酶標儀上測定各孔光吸收值。以時間為橫軸，每次3孔的平均光吸收值繪制ADSC細胞生長曲線。

1.9 ADSC預誘導和誘導劑的配制

預誘導劑：NMPP+2 nmol/L BME+無血清DMEM 培養基 NMPP 成分：（DMEM）：HAMS F12（50︰50）+bFGF 20 ng/mL+EGF 20 ng/mL+N2；1︰100誘導劑：10 nmol/L BME+無血清DMEM培養基。

1.10 ADSC的誘導分化

分別取制備的細胞爬片2片用于誘導分化，誘導分化步驟：預誘導24 h+誘導劑5 h。分化過程中每隔數小時動態觀察一次ADSC的形態，對誘導后的ADSC細胞爬片進行NSE、GFAP免疫熒光染色，鑒定ADSC的分化結果。分別設置陰性和陽性對照，熒光顯微鏡下觀察結果，用藍色激發光觀察GFAP染色情況，用綠色激發光觀察NSE染色情況。

1.11 ADSC分化過程中Nestin的動態表達的半定量統計分析

取4片ADSC細胞爬片進行預誘導，加入預誘導劑后，分別在第6、12、18和24 h取出其中的一片，對其進行Nestin免疫組化染色：染色完畢后顯微鏡下觀察，尋找Nestin陽性細胞。Nestin為細胞漿-細胞膜型表達方式，以細胞輪廓出現棕色染色為陽性細胞。每個爬片隨機取5個非重疊高倍視野進行Nestin陽性細胞和總細胞數計數，并計算Nestin陽性細胞率。結果用SPSS11.0統計軟件包進行分析，采用其中多個樣本率的χ2分割檢驗法，根據要求計算檢驗水準P為0.007。

2 結果

2.1 ADSC細胞形態

剛從脂肪組織分離的原代ADSC細胞在相差倒置顯微鏡下呈單細胞懸浮狀態，體積較紅細胞大、橢圓形，胞核稍暗。觀察發現，原代接種3 h后開始貼壁，并在48 h內開始伸展。約96 h完全伸展后，細胞形狀為細長梭狀，胞核位于中央與胞漿對比明顯，嚴格按貼附方式生長，此時在外形上和骨髓干細胞難以區別。細胞以集落形式增殖，7～8 d后細胞生長匯合并停止生長（圖1），每一代細胞之間無明顯形態學差異。

圖1 生長匯合的ADSC，長梭形，貼壁生長（×200）

圖2 ADSC的CD44免疫熒光染色呈強陽性（×200）

2.2 ADSC表達CD44

免疫熒光法檢測到ADSC強陽表達CD44（圖2），為胞漿表達形式，細胞輪廓被熒光清晰襯托。

2.3 ADSC的貼壁率

表1 接種24 h內ADSC的貼壁率

說明傳代培養的ADSC能在接種后的24 h內貼壁完全。

2.4 ADSC的生長曲線

采用MTT法測定的細胞生長曲線（圖3）較真實的反映了其生長情況，從曲線上可以看出，ADSC生長活躍，增殖能力強，具有對數生長型的曲線模式且對數生長期明顯。在完全貼壁第9天后，細胞數目不再增加，采用繪圖法得出其倍增時間為4 d。

圖3 ADSC生長曲線

2.5 ADSC向神經細胞的定向分化

ADSC在預誘導階段形態變化不明顯，在加入誘導劑后僅1 h，就可見部分細胞開始由梭狀變為橢圓形，并向周圍伸出數個較長突起（圖4），在誘導結束后，幾乎所有細胞均表現為神經元的外形，突起明顯，細胞密度較誘導前變化不大，未見膠質樣細胞。ADSC在分化結束后明顯表達NSE而不表達GFAP（圖 5）。檢測 ADSC 預誘導后 6、12、18和 24 h Nestin陽性細胞的比例，結果用（均數±標準差）（±s）形式表達，以0.007為檢驗水準P，每兩個率的均數分別行χ2檢驗。可見，Nestin陽性細胞胞漿均勻呈棕色，與背景區別明顯，胞核清晰且便于計數（圖6），陰性和陽性細胞形態無明顯差別，未見明顯非特異性著色。SPSS11.0統計軟件包進行分析，P值均小于0.007，故認為每個時間點的Nestin陽性細胞率差異有顯著性（表2）。可以認為，在預誘導ADSC向神經細胞分化的過程中，逐漸減弱對標志NSC的Nestin的表達，提示ADSC的分化機制中缺乏經歷NSC再沿著后者的分化路徑分化的證據。

圖4 誘導1 h可見有細胞變為神經元形態，并向周圍伸出突起（×200）

圖5 誘導結束后，ADSC分化為神經元強烈表達 NSE（熒光染色）（×200）

表2 不同時間點的Nestin陽性率（±s）

表2 不同時間點的Nestin陽性率（±s）

時間（h）612 18 24 Nestin陽性率%21.83±1.99 16.51±2.73 12.68±1.39 9.80±2.78

圖6 ADSC預誘導6 h后Nestin免疫組化染色，陽性細胞呈棕黃色（×200）

圖7 ADSC預誘導24 h后Nestin免疫組化染色，陽性細胞呈棕黃色（×200）

3 討論

脂肪組織和骨髓同屬中胚層，科學家們渴望在脂肪中發現類似骨髓干細胞的細胞。最早的研究是基于抽脂手術獲取的脂肪組織。普通的脂肪細胞在體外培養中懸浮生長，而有少部分梭狀呈貼附生長的亞群有相當的分裂增殖能力，最早稱其為脂肪組織提取細胞（processed-lipoaspirate cells，PLAC）。后來，逐漸明確其亦有多向分化的潛能。ZUK等人通過檢測相關分子的表達，排除了脂肪組織中存在軟骨、骨、肌細胞等存在的可能[1]。目前已有研究證實這是一類全新的干細胞，稱其為ADSC[2，3]。已證明ADSC穩定表達 HLA-ABC、CD44、CD106、CD166等分子[4]，但尚無特異性很高的表面標志可用于鑒定，故對前者的認定需結合其活躍穩定的增殖能力、多向的分化潛能和CD44等干細胞所普遍表達的表面分子等多方面因素綜合考慮。

ADSC取材于細胞成分單純的脂肪組織，可以在持續自我復制增殖和傳代。CD44是目前所發現的成體干細胞最廣泛表達的標志物[5]，分布于胞膜和胞漿，它的存在可以進一步證明干細胞的身份。盡管對于干細胞的定義不強調細胞的表型，但對于其表型的研究可以為我們在細胞篩選、探究細胞亞群等工作中提供幫助。實驗中觀察到ADSC強烈表達CD44，可以回顧性的支持對于ADSC干細胞的命名。貼壁率和生長曲線是細胞生長特征的重要指標，在傳代后24 h其貼壁率為96.6%，其貼壁速度之快和效率之高遠超過大多數培養細胞。在后續的細胞培養工作中，可以充分利用這種特點，即在傳代后不久就可行其它處理，為我們提高工作效率提供了理論的支持。ADSC的生長過程呈典型的對數生長，三個生長階段明顯對稱，其倍增時間僅4 d，足以襯托其分裂的高效率。也能夠解釋在將ADSC向神經細胞預誘導時，絲裂原bFGF可以在短期內使ADSC數量明顯增加。

美國加利福尼亞大學的ZUK等人于2001年最早嘗試將ADSC向神經方向誘導分化，他們使用10%FBS DMEM 誘導劑（5μg/mL胰島素+200μM吲哚美辛+0.5mM二甲基亞甲基黃嘌呤）。持續誘導ADSC 2周，有43%的細胞分化為神經元[6]。后來發現，這種誘導方法不僅費時，而且誘導分化效率不高。本文借鑒了WOODBURY雞尾酒式的分階段誘導方式[7]，而且在預誘導劑中加入了含較高濃度神經營養因子的神經祖細胞維持培養基（NPMM）以減少誘導劑對分化中細胞的毒性[8]。本實驗中分化后的細胞免疫熒光染色僅表達神經元特異性標志物NSE，而不表達膠質細胞標志物GFAP，說明經以上方法誘導后，ADSC大多分化為神經元，而不向膠質方向分化，這與形態學的觀察結果相符合。我們觀察ADSC分化的過程中，神經干細胞特異性標志物Nestin表達率是逐漸下降，所以ADSC的分化徑線與機制與骨髓干細胞是有差別的，前者不經歷神經干細胞的中間階段，因而分化產物中也沒有神經膠質細胞。

ADSC來源充足，培養方便而且易于向神經元誘導分化，有望成為我們解決中樞神經系統神經元難以再生的有利工具。

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