響應面優化營養鹽對甜高粱莖桿汁液發酵產乙醇的影響

王 敏王 頡孫劍鋒牟建樓

(河北農業大學食品科技學院1,保定 071001)

(河北衡水學院生命科學系2,衡水 053000)

響應面優化營養鹽對甜高粱莖桿汁液發酵產乙醇的影響

王 敏1,2王 頡1孫劍鋒1牟建樓1

(河北農業大學食品科技學院1,保定 071001)

(河北衡水學院生命科學系2,衡水 053000)

燃料乙醇作為石油替代產品之一,可緩解能源供應的壓力。以甜高粱秸稈為原料,研究營養鹽對發酵生產乙醇產量的影響。在單因素試驗基礎上,利用 Box-Behnken中心組合設計響應面法對甜高粱莖稈汁液發酵添加營養鹽(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2對發酵生產乙醇的影響進行了研究。結果表明,在甜高粱莖稈汁液發酵過程中,通過響應面分析建立添加營養鹽與發酵液酒精度之間的回歸模型 Y=9.92-0.13X1+0.32 X2-0.23 X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66 X22-0.77 X32-0.76 X42可用于生產預測,最適宜添加量 (NH4)2SO4為 4.61 g/L,MgSO4為 1.64 g/L,KH2PO4為 2.72 g/L,CaCl2為2.82 g/L。在此條件下進行驗證試驗,重復 3次,酒精度為 9.9%。

Box-Behnken 響應面法 甜高粱汁 營養鹽

隨著石油燃料供應日趨緊張和環保呼聲的日益高漲,尋找和發展替代石油的新能源成為當務之急。目前世界各國均在開展生物質能源的研究工作,主要原料為淀粉質原料(如玉米,美國模式)、糖質原料(如甘蔗,巴西模式)[1-2]。此外,農作物秸稈[3]等木質素原料生產燃料乙醇的研究已經取得階段性進展。

我國國家統計局數據表明,2006年我國石油生產量 18 476.6萬噸,進口量 19 453.0萬噸[4],因此,利用可再生能源作為石油的替代品變得愈加重要。2000年我國開始啟動以玉米陳化糧為原料的燃料乙醇項目,已取得初步成效。但是使用這些原料存在與糧爭地、與人爭糧的問題。因此,必須尋求一種不與糧爭地、不與人爭糧、不與牲畜爭飼料、不與其他產業爭原料的作物。而甜高粱因符合以上條件而成為較有前途的生物質原料之一[5-6]。

甜高粱是一種高生物量和高糖 C4植物,適應性較強,抗逆性好,在比較貧瘠的土地上可達萬斤以上,其莖稈含汁量為 60%～80%,汁液的糖錘度為10%～20%,汁液中含有蔗糖、葡萄糖、果糖等糖份。甜高粱莖稈汁液接種酵母發酵成乙醇,再經精餾即可按一定比例混合到汽油中作為汽車燃料,無論是從經濟性還是從解決能源、糧食安全的角度看,都具有廣闊的發展前景。因此利用甜高粱液態發酵生產乙醇已成為生物質能源領域中的重要研究課題之一。目前對甜高粱莖稈汁液液態發酵工藝研究報道較多[7-8],而在發酵過程中添加營養鹽的研究較少,例如張恩銘等[9]在甜高粱莖稈汁液發酵過程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2,利用正交試驗確定最適添加量;劉榮厚等[10]應用正交試驗確定了在甜高粱莖稈汁液發酵過程中添加 (NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4的濃度;康利平等[11]確定在發酵過程中添加尿素、MgSO4、CaCl2等可以提高乙醇產率,而利用響應面法優化營養鹽對甜高粱莖稈汁液發酵生成乙醇產率影響的內容未見報道。

響應面 (response surface methodology,RS M)是一種綜合試驗設計和數學建模,通過局部試驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關系,從而得出數學模型的方法。同時對影響生物產量的各因素水平及其交互作用進行優化與評價,因此可快速有效地確定多因素系統的最佳條件[12]。近年來 RS M方法日益受到重視,已在食品品質評價[13]、乳酸生產[14]、新藥研制與開發[15-17]等領域得到廣泛應用。

研究采用響應面對甜高粱液體發酵過程添加營養鹽的效果進行考察和評價,確定較優的發酵條件,以備為后續放大試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱:品種四粒美,2008年 10月采于河北農業大學農場;菌種:丹寶利釀酒高活性干酵母,廣東丹寶利酵母有限公司;(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2:分析純,天津市永大化學試劑開發中心。

1.2 儀器

PR101數字折光儀:日本 ATAGO;LRH-250A生化培養箱:廣東省醫療器械廠;三輥式榨汁機:利寶達廚具機械廠;酒精比重計:河北紅旗儀表有限公司。

1.3 試驗設計

響應面法是通過近似構造一個具有明確表達形式的多項式來表達隱式功能函數。響應面法是一套統計方法,用這種方法來尋找考慮了輸入變量值的變異或不確定性之后的最佳響應值。在響應曲面的最優點附近,曲面效應是主導項,用二階模型來逼近響應曲面。

每個不同變量 X1,X2,X3,…,Xk,表示不同的參數,每個參數的低、中、高水平分別為 -1,0,+1,見式(1):

式中:Xi和 xi分別代表實際值和編碼值;X0為Xi的中心點,Δx為變化值[18]。

廣義響應面模型描述反應變量的變化[19]見式(2):

式中:Y為預測值;β0為回歸系數;βi為 xi的線性效應;βii為 Xi的二次效應;βij為 Xi與 Xj間的線性交互效應[20]。

選用四種營養鹽,其 Box-Behnken試驗參數水平見表 1,結果用統計軟件 Design Expert 7.1.3分析,編碼試驗因素和水平根據前期單因素試驗進行設計列于表1。

根據單因素試驗結果,采用 Box-Behnken的中心組合設計對影響發酵的四種營養鹽 (NH4)2SO4、 MgSO4、KH2PO4、CaCl2進行研究。

因素 符號 編碼水平-1 0 +1 (NH4)2SO4X11 5 9 MgSO4X21 1.5 2 KH2PO4X31.5 3 4.5 CaCl2X40 2.5 5

1.4 液態發酵

榨汁:甜高粱秸稈于 2008年 10月收獲后去葉,用三輥式榨汁機壓榨,將甜高粱汁保存于 -18℃的冰柜中,備用。

菌種活化:取定量丹寶利釀酒高活性干酵母溶于 2%蔗糖水中,38℃條件下活化 30 min,然后在34℃活化 1 h,備用。

取 20 Birx的甜高粱汁 200 mL加入到 500 mL的三角瓶中,按 5%接種量接入三角瓶,添加不同的營養鹽,置于(30±2)℃發酵 3 d后測定酒精度。

1.5 酒精度的測定

取 100 mL發酵成熟醪液于 500 mL蒸餾瓶中,加 50 mL蒸餾水混合均勻進行蒸餾,用 100 mL容量瓶收集餾出液至 100 mL,酒精含量用酒精比重計法測定,并校正至 20℃時的酒精度[21]。

2 結果與分析

2.1 回歸模型的確定

Box-Behnken中心組合試驗結果見表 2。回歸方程各項回歸系數顯著性檢驗見表 3。

以 (NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2為自變量,發酵液酒精度為因變量 Y,建立甜高粱莖稈汁液添加營養鹽發酵回歸模型。由表 3可知,X1、X2、X3、X4的線性項,X1、X2、X3、X4的平方項,X1與 X2,X1與 X3的交互作用對甜高粱莖稈汁液發酵的作用是非常顯著的。

利用Design Expert 7.1.3回歸擬合試驗數據,初步得到回歸方程為:

由表 3可知,X1、X2、X3、X4及其平方項、X1X2、X1X3回歸系數置信度均在 95%以上,關系顯著,其他不顯著,所以回歸方程優化精簡為:

表 2 Box-Behnken設計與試驗結果

表3 回歸方程各項回歸系數顯著性檢驗

表4 回歸模型方差分析

由表 4可知,回歸方程方差分析顯著性檢驗表明,該模型失擬不顯著,回歸顯著,模型極顯著 (P< 0.000 1)。預測值與實測值之間具有高度的相關性系數R2adj=0.966 2,說明模型能解釋 96.62%的響應值變化。調整相關系數 R2adj=0.932 5,僅有 6.75%的變異不能由該模型解釋,因此回歸方程的擬合程度很好,預測值和實測值之間具有高度的相關性,可以用于甜高粱汁液態發酵添加營養鹽生產燃料乙醇的理論預測。

2.2 發酵優化工藝參數的驗證

圖形能夠提供一種形象的觀測響應值和試驗參數水平關系的直觀方法。為了觀察在其他因素條件固定不變的情況下,某兩因素對發酵的影響,通過上面多元回歸方程做 X1與 X2,X1與 X3的響應曲面及其等高線圖,結果見圖 1～圖 2。

圖 1 響應曲面(X1,X2)和等高線圖

圖 2 響應曲面(X1,X3)和等高線圖

圖 1表示(NH4)2SO4、MgSO4的交互作用對酒精度的影響。由圖 1可知,二者交互作用顯著。這是因為等高線的形狀可以反映交互效應的強弱。圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。在 (NH4)2SO4質量分數較低時,隨著MgSO4增大得到的酒精度曲面較陡,這說明較低的(NH4)2SO4質量分數對的MgSO4增加較敏感,但是隨著MgSO4的質量分數不斷增加,發酵液酒精度變化呈先增大后減小的趨勢。

圖 2表示 (NH4)2SO4和 KH2PO4對發酵產物的影響。在 MgSO4和 CaCl2中心點時,(NH4)2SO4和KH2PO4交互作用顯著。隨著(NH4)2SO4和 KH2PO4添加量的增加,發酵液酒精度先增加后下降。

為了求得最佳發酵工藝條件,對所得的回歸擬合方程分別對各自的變量求一階偏導數,并令其為0,得到三元一次方程組,求解此方程組可以得出模型的極值點:X1=-0.098 6,X2=0.279,X3= -0.184,X4=0.127,即 (NH4)2SO4=4.61 g/L, MgSO4=1.64 g/L,KH2PO4=2.72 g/L,CaCl2=2.82 g/L,理論預測酒精度 Y=9.99%。在此條件下進行驗證試驗,重復 3次,酒精度為 9.9%。

3 討論

營養鹽可為酵母提供營養,促進增殖,改善酵母細胞的生長環境。張恩銘等[9]以總糖質量濃度為178.5 mg/mL的高粱汁液發酵,經正交試驗確定(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2的添加量為為 1、10、5、5 g/L;康利平等[11]采用總糖為 18.03%的甜高粱汁液發酵,經正交實驗的最佳營養鹽添加量為3 g/L尿素,2.5 g/L MgSO4·7H2O,CaCl2·2 H2O 5 g/L,酒精度為 8.35%;王鋒等[22]采用總糖質量分數為 21.7%的甜高粱汁液發酵,同時在發酵過程中添加了 (NH4)2SO4,KH2PO4,MgSO4,經正交試驗驗證MgSO4對發酵無益,添加 2 g/L(NH4)2SO4, 5 g/L KH2PO4可得酒精 94.5 g/L。從文獻報道中可知,對于營養鹽的添加種類及數量不盡相同,除了初始含糖差異,還可能與甜高粱品種及產地造成的莖稈汁液成分差異、以及酵母菌種有關。

4 結論

通過響應面分析建立的甜高粱汁發酵過程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2與酒精度之間的回歸模型高度顯著,可用于生產預測。回歸方程:Y= 9.82-0.12X1+0.32X2-0.23X3+0.18X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.65X12-0.61X22-0.72X32-0.71X42。添加量分別是 (NH4)2SO4為 4.61 g/L、MgSO4為1.64 g/L、KH2PO4為 2.72 g/L、CaCl2為2.82 g/L,于甜高粱汁液態發酵,酒精度為 9.9%。由此可知,在甜高粱莖桿汁液液態發酵過程中添加營養鹽有利于乙醇的生成。

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Opti mization ofNutrition SaltDoses for Ethanol Fer mentation of Sweet Sorghum Juice with Response SurfaceMethodology

WangMin1,2Wang Jie1Sun Jianfeng1Mou Jianlou1
(College of Food Science and Technology,AgriculturalUniversity of Hebei1,Baoding 071001)
(Department ofLife Science,HengshuiUniversity2,Hengshui 053000)

As one of petroleum substitutes,fuel ethanol will relieve the world energy stress.Using sweet sorghum straw as raw material of ethanol fermentation.the influence of adding nutrition salts on the fermentation was studied. Based on single factor experiments,Box-Behnken central composite design of response surface methodologywas ap2 plied to optimize the addition of nutrition salts including(NH4)2SO4,MgSO4,KH2PO4,and CaCl2for the ethanol fer2 mentation process of sweet sorghum juice.Results:The applicability of the model equation Y=9.92-0.13X1+ 0.32X2-0.23X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66X22-0.77X32-0.76X42for predicting the optimum response values is verified effectively by experi mental data.The obtained optimum adding dosesof these salts are(NH4)2SO44.61 g/L,MgSO41.64 g/L,KH2PO42.72 g/L,and CaCl22.82g/L.The validate test shows the prod2 uct alcohol content is 9.9%.

Box-Behnken,response surface methodology,s weet sorghum juice,nutrition salts

TK6 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)03-0107-06

保定市科技局生物質能源加工關鍵技術研究(07N12)

2009-04-05

王敏,女,1977年出生,講師,博士,食品加工與安全

王頡,男,1959年出生,教授,博士生導師,食品科學