煎炸油及其加熱產生的極性物質致突變性研究

劉元法 穆 昭 單 良 范柳萍 王興國

(江南大學食品學院,無錫 214122)

煎炸油及其加熱產生的極性物質致突變性研究

劉元法 穆 昭 單 良 范柳萍 王興國

(江南大學食品學院,無錫 214122)

煎炸過程中,煎炸油發生了氧化、水解、聚合等反應發生,導致煎炸油中的極性物質含量升高。通過Ames試驗和骨髓微核率試驗對煎炸油及煎炸油中的極性物質的致突變性進行研究。在不加 S9時,煎炸油中分離出的極性物質對鼠傷寒沙門氏菌 TA100的致基因突變作用并存在劑量反應關系 y=14.992e0.27x,煎炸后煎炸油、加熱后煎炸油以及極性物質對 TA102都存在劑量反應關系分別為 y=100.97e0.0736x、y=84.992e0.0936x、y=129.65e0.0567x,在加入 S9后各試驗組對 TA97、T A100、TA102都存在劑量反應關系。極性物質導致小鼠骨髓多染紅細胞的微核率升高,其中高劑量組(17.44±0.43)‰,并呈劑量反應關系 y=3.455 3lnx+ 22.979。煎炸油及其極性成分具有致突變作用。

煎炸油 極性物質 致突變性 Ames試驗骨髓微核率

在煎炸過程中,煎炸油長時間處于高溫、與氧氣接觸導致煎炸油中的甘油三酯發生氧化反應,產生氧化產物,醛、酮、酸以及烴類,同時,煎炸食品帶入體系的水在高溫催化下,導致煎炸油中的甘油三酯水解,產生游離脂肪酸等。另外,多雙鍵脂肪酸的分子容易聚合,聚合有兩種形式即熱聚合和氧化聚合[1]。這些氧化、水解、聚合等反應產物,即為煎炸油中的極性物質,在煎炸過程中煎炸油的極性物質含量隨煎炸時間而增加,同時煎炸油中對健康有害的成分含量增加,導致基因突變、染色體突變從而誘發癌癥如乳腺癌、結腸癌等[2-3]。

人體在致突變物質即誘變劑的作用下可產生兩種嚴重的后果,其一是致突變原可引發人類生殖細胞遺傳物質的突變,導致下一代遺傳性疾病發病率的升高,其二是致突變原引發的人體細胞遺傳物質的突變可導致各種紊亂,其中最嚴重的后果是腫瘤或癌癥的發生。從遺傳毒理學角度講突變主要分為兩大類:基因突變和染色體畸變。基因突變可以通過Ames試驗進行檢驗,即利用是否能引起鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型 (hisˉ)菌株的回復突變來判斷化學物質是否為誘變劑和致癌劑,并能區別突變的類型(置換或移碼突變)[4]。微核率可以體現受試物是否導致染色體突變(在染色體斷裂劑的作用下,均能產生微核)[5]。

國內外對于煎炸油使用后對人體的影響逐漸開始研究,Lin等[6]對每日食用煎炸油對大鼠的自身免疫系統的影響進行了研究,周純先等[7]和沈玲玲等[8]研究了反復煎炸油的致突變性和油脂煎炸后對動物的影響,認為煎炸油在煎炸后對動物自身免疫和致突變性都有明顯影響。從研究文獻來看,國內外對煎炸油對人體健康研究相對較少,研究主要針對油本身的變化和對人體的影響,對其中有害物質的研究未見相關報道,通過Ames試驗和骨髓微核率試驗來研究煎炸油及其極性物質的致突變性,進一步明確煎炸油在使用后對人體的影響和關鍵影響因子對于食品安全研究和控制具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 主要原料和試劑

組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌 TA97、TA100、TA102:上海市疾病控制中心;3只大鼠:浙江省動物實驗中心;昆明小鼠 140只:浙江省動物實驗中心。

二甲基亞砜、環磷酰胺、苯巴比妥鈉、β-萘黃酮、NADP、G-6-P、L組氨酸、生物素、甘油三酯測定試劑盒:溫州津瑪生物有限公司;總膽固醇測定試劑盒:溫州津瑪生物有限公司;超氧化物歧化酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、丙二醛測定試劑盒:南京建成科技有限公司。

1.2 試驗儀器

HRM-242ⅡP高壓殺菌鍋:華粵行儀器有限公司;MJL-8A煎炸鍋:上海來爾佳餐飲管理有限公司;BT-1600圖像顆粒分析系統:丹東市百特儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 受試物質的制備

煎炸后煎炸油:煎炸油在 180℃溫度下煎炸雞腿,每批 5只,每小時一批,直至煎炸油中的極性物質含量達到 25%(極性物質含量檢測采用硅膠柱層析AOCS方法)。

加熱后煎炸油:煎炸油在 180℃溫度下于油浴鍋中加熱,直至煎炸油中的極性物質含量達到25%(極性物質含量檢測采用硅膠柱層析 AOCS方法)。

煎炸后煎炸油中極性物質:采用上面方法制備煎炸后煎炸油,然后采用硅膠柱分離出其中的極性成分。首先用石油醚:乙醚 87:13(V/V)的洗脫液進行洗脫,將吸附在硅膠柱中的煎炸油中非極性物質洗脫下來,然后用乙醚將極性物質洗脫下來,旋轉蒸發溶劑,得到煎炸后煎炸油中的極性物質。

在Ames試驗中將上述各受試物溶解在二甲基亞砜中,質量濃度分別為 50、20、5mg/mL(根據Ames試驗受試物劑量 5、2、0.5 mg/皿,添加量:100μI)。

2.2 代謝活化系統 S-9的制備

成年雄性大白鼠 3只 (體重 300 g左右),稱重,灌胃 80 mg/kg苯巴比妥鈉和80 mg/kgβ-萘黃酮連續3 d,殺前大鼠禁食16 h,取3只大白鼠的肝臟合并后稱重,用 0.15 mol/L KCl溶液洗滌 3次,剪碎,每克肝臟(濕重)加 3 mL 0.15 mol/L KCl溶液,制成勻漿,離心(9 000 r/min),取上清液 (即 S-9)分裝小試管,每管 1～2 mL,液氮速凍,-20℃冷藏備用。所用器皿、刀剪、溶液都需保持無菌,并在 0～4℃下(也可在冰浴中)操作。

每 100 mL NADP和 G-6-P使用液含 NADP 297 mg,G-6-P 152 mg,0.2 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液 50 mL(Na2HPO4·12H2O 7.16g,KH2PO42.72 g,加水至 100 mL,滅菌后備用),鹽溶液 2 mL(MgCl28.1 g、KCl 12.3 g加水至100 mL,滅菌后備用),加水至 100 mL。細菌過濾器過濾除菌,經無菌試驗后分裝成每瓶 10 mL的小瓶,-20℃儲存備用。

取 2 mL S-9加入 10 mL NADP和 G-6-P使用液(將低溫貯存 S-9和使用也室溫下融化后現配現用),混合液置冰浴中,用后多余部分棄去。

2.3 菌株的增菌培養

菌株組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌 TA97、TA100、TA102,增菌培養用牛肉膏蛋白胨液體培養基,接種后于 37℃,100 r/min振蕩培養 12 h左右,含菌數應為 1×109個/mL～2×109個/mL。(由于紫外線對組氨酸營養缺陷型鼠沙門氏菌具有紫外線修復作用,因此培養過程要避免光照)。

2.4 菌株鑒定

用于測試的菌株,需經基因型和生物學性狀鑒定,符合要求才能投入使用。

(1)脂多糖屏障丟失 (rfa);(2)R因子劃線接種,貼放濾紙條浸濕的藥液為氨芐青霉素鈉溶液。TA102除 pK M101外,還有 pAQ1,載有抗四環素的基因,故另用濾紙條浸濕四環素溶液后貼放于劃線接種的平板上;(3)紫外線損傷修復缺陷 (△uvr B)鑒定;(4)自發回變鑒定;(5)回變特性——診斷性試驗上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物之溶液(環磷酰胺),需活化系統者并加入 S9,其他同上。

2.5 Ames試驗

受試菌株:TA97、TA100、TA102。溶劑:二甲基亞砜(受試物溶解在溶劑中,濃度根據劑量不同而變化)。陽性組:環磷酰胺。陰性組:二甲基亞砜。劑量:5 mg/皿、2 mg/皿、0.5 mg/皿。

試驗采用平板滲入的方法,將含組氨酸生物素溶液的頂層培養基 2.0 mL分裝于試管中,45℃水浴中保溫,然后每管依次加入試驗菌株增菌液 0.1 mL,受試物溶液 0.1 mL和 S9 0.5 mL(需代謝活化時),充分混勻,迅速傾入底層瓊脂平板上,轉動平板,使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后,倒置于 37℃培養箱里 48 h,計數每皿回變菌落數。

試驗除設受試物個劑量組外,同時設空白對照(自發突變)、溶劑對照 (二甲基亞砜)、陽性對照 (環磷酰胺),每個劑量做三個平行皿。

2.6 骨髓微核率試驗

70只小鼠雌雄各半,雌雄各隨機分組每組 5只,分為 7個組。小鼠預飼養 3 d,體重 22 g左右,其中第一組為陰性組,灌生理鹽水 0.2 mL/只,第二組陽性組環磷酰胺,劑量 50 mg/kg體重,第三組極性成分劑量 0.2 mL/只,第四組極性成分 0.1 mL/只,第五組極性成分 0.05 mL/只,第六組煎炸后煎炸油劑量0.2 mL/只,第七組加熱后煎炸油0.2 mL/只。小鼠預飼養 3 d,連續灌胃 7 d,第 7天禁食 24 h后,稱體重,斷脊椎處死,取肝臟稱重,計算臟器系數。取股骨用剪刀剪斷兩端,用鑷子擠出骨髓與預先滴在載玻片上的小牛血清混合,制片,Giemsa染色 (核染色),油鏡鏡檢,通過 BT-1600圖像顆粒分析系統CCD分析,每個小鼠檢出 1 000個細胞,計算微核率。

2.7 試驗結果評價方法

Ames試驗組的回復突變菌落數超過自發回復突變菌落數的 2倍以上,呈劑量 -反應關系,有重復性,則為陽性。

3 結果與討論

3.1 菌株鑒定結果

經過脂多糖屏障丟失、抗藥性、紫外線損傷修復缺陷、自發回變、回變特性等試驗對試驗菌株進行鑒定,鑒定結果表明該菌株滿足 Ames試驗要求,可以用于Ames試驗。

3.2 未加 S9 Ames試驗結果

鼠傷寒沙門氏菌的突變型(即組氨酸缺陷型)菌株在無組氨酸的培養基上不能生長,在有組氨酸的培養基上可以正常生長。但如在無組氨酸的培養基中有致突變物存在時,則沙門氏菌突變型可回復突變為野生型(表現型),因而在無組氨酸培養基上也能生長,故可根據菌落形成數量,檢查受試物是否為突變物。在不加 S9的情況下,Ames試驗結果如表1和表2所示。

表1 不加 S9 Ames試驗結果/突變菌落數/皿

表2 不加 S9時煎炸油Ames試驗劑量反應關系

極性物質對于組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌 TA100、TA102致突變性呈陽性,并存在劑量反應關系。加熱后煎炸油對于組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌 TA102呈陽性,存在劑量反應關系,煎炸后煎炸油對于組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA102呈陽性,存在劑量反應關系。TA97對于受試物都成陰性,其中 TA97用于移碼型基因突變的檢出,TA100、TA102用于堿基置換型突變的檢出, TA102的敏感性更高,即煎炸油中極性物質、加熱后煎炸油以及煎炸后煎炸油都將導致鼠傷寒沙門氏菌的堿基置換型突變,而在不加 S9的情況下不會導致移碼型基因突變。

從 TA100的試驗結果可以看出,從煎炸后的煎炸油分離出的極性物質致突變作用較明顯,煎炸后煎炸油次之,而加熱后煎炸油的致突變作用較弱,這與加熱作用下與煎炸過程中的反應不同有關。在加熱過程中,發生氧化反應、聚合反應,而在煎炸過程中,由于食品帶入體系中水分、空氣使得煎炸油發生水解、氧化等反應,可能是水解后產生的脂肪酸以及水解產物甘二酯等的氧化產物比單純的氧化反應的氧化產物有更強的致突變作用,另外,也可能是在煎炸過程中食品的作用,與煎炸油之間發生的化學反應的產物更具有致基因突變作用。

3.3 加入激活酶 S9 Ames試驗結果

某些致突變劑只有進入生物體內被代謝活化系統活化后方具有致突變作用,在Ames試驗中常用的有大鼠或其他哺乳動物肝臟的微粒體成分 (主要含有混合功能氧化酶系統)。本試驗中代謝活化系統是用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮 (現在多氯聯苯禁用)誘導的大鼠肝勻漿制備的 S-9混合液。在加入代謝活化劑 S9后,Ames試驗結果如表 3所示,劑量反應關系如表 4所示。

表3 加 S9 Ames試驗結果

表4 加入 S9后煎炸油Ames試驗劑量反應關系

相對于不加 S9加入代謝活化劑 S9后,極性物質、煎炸后煎炸油對于 TA97都產生陽性結果,加熱后煎炸油、煎炸后煎炸油對 TA100產生陽性結果。S9為肝的混合功能氧化酶系統,從試驗結果可以看出,受試物極性物質和煎炸后煎炸油對于 TA97的致突變作用需要代謝活化劑,加熱后煎炸油和煎炸后煎炸油對 TA100的致突變作用需要代謝活化劑。

煎炸油中極性物質、煎炸后煎炸油、加熱后煎炸油在不加代謝活化系統的情況下導致鼠傷寒沙門氏菌發生堿基置換型基因突變,而不會導致移碼型基因突變,在代謝活化系統的作用下也可導致鼠傷寒沙門氏菌的移碼型基因突變。

3.4 骨髓微核率

3.4.1 煎炸油對體重增加、臟器系數的影響

臟器系數為肝臟重量與體重的比值,由于肝臟為體內解毒系統,在致癌物進入代謝系統后肝臟發生癌變將導致肝臟的質量改變 (腫大或萎縮),進而影響臟器系數,因此通過臟器系數的變化可以說明煎炸油對小鼠的毒性作用。試驗結束時小鼠的體重增加以及臟器系數結果如表 5所示。

表5 小鼠體重增加和臟器系數

經過 7 d的灌胃,雄性陽性組與陰性組相比體重增加差異顯著,環磷酰胺影響導致小鼠的體重增加緩慢,極性物質高劑量組與陰性組相比體重增加差異高度顯著,煎炸后煎炸油與陰性組相比體重增加差異顯著,其他組與陰性組相比體重增加差異無顯著性。各組的臟器系數顯著低于環磷酰胺陽性組,與陰性組相比差異不顯著,這與 Lin[6]的結論相一致,原因是灌胃時間較短,煎炸油的作用較弱,臟器系數變化需要長時間才能顯示出來,因此結果不顯著。從體重的增加可以看出煎炸后煎炸油和從煎炸后煎炸油中分離出的極性物質對其影響較大,對小鼠的體重增長有一定的抑制作用,而加熱后煎炸油的作用弱,說明在煎炸過程中水分、食品等影響產生的極性物質的作用大于單純由于高溫而產生的產物的影響。

經過 7 d的灌胃,小鼠的骨髓多染紅細胞產生的微核如圖 3所示,微核為紅細胞大小的十分之一,正常紅細胞呈紅色,染色體突變產生微核經吉姆薩核染色后呈藍紫色。

圖3 骨髓微核

各組微核率的試驗結果如表 6所示,從表中可以看出經過 7 d的連續灌胃極性物質、煎炸后煎炸油、加熱后煎炸油的微核率與陰性組比較顯著升高,但是顯著低于環磷酰胺。煎炸油中極性物質對微核率呈劑量反應關系,y=3.455 3lnx+22.979,R2= 0.999 8,煎炸油導致染色體突變即微核率上升,其中煎炸油中的極性物質是導致染色體突變的原因,與煎炸后煎炸油相比加熱后煎炸油對染色體的致突變作用較弱,可以說明只是加熱對于油的危害小,在煎炸過程中食品與煎炸油之間的反應導致煎炸油中產生更多的致突變物質,如水分、蛋白質、淀粉等物質的影響。

表6 骨髓微核率

4 結論

4.1 煎炸油中極性物質、煎炸后煎炸油、加熱后煎炸油在不加代謝活化系統的情況下導致鼠傷寒沙門氏菌發生堿基置換型基因突變,而不會導致移碼型基因突變,在代謝活化系統的作用下也可導致鼠傷寒沙門氏菌的移碼型基因突變。煎炸油中分離出的極性物質對鼠傷寒沙門氏菌的致基因突變作用較強,而煎炸后煎炸油、加熱后煎炸油依次次之,說明導致長時間煎炸后煎炸油中有害物質為其中的極性物質。

4.2 在微核率試驗中,煎炸油中極性物質高劑量組和煎炸后煎炸油小鼠的體重增加顯著低于陰性組,對小鼠的生長具有抑制作用,對臟器系數 (肝臟)的影響不顯著。

4.3 極性物質導致小鼠骨髓多染紅細胞的微核率升高,并呈劑量反應關系。

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Mutagenicity of FryingOil and its Polar Components For med in Heating

Liu Yuanfa Mu Zhao Shan Liang Fan Liuping Wang Xingguo
(School of food science and technology of Jiangnan University,Wuxi 214122)

Several chemical changes of frying oil occur during heating,inducing oxidation,hydrolysis reaction and polymerization,and the content of polar compounds increases.The mutagenicity of frying oil and its polar com2 poundswere evaluated in thiswork by conductingAmes test and bone marrow microkernel rate experi ment.In the A2 mes testwithout S9,for TA100 the relationship between mutagenicity and polar compound content of frying oil isy= 14.992e0.27x,and for TA100 the relationships between mutagenicity and fried frying oil,heated frying oil,polar com2 pounds arey=100.97e0.0736x,y=84.992e0.0936x,y=129.65e0.0567x,respectively;there is dose-response relation2 ship in every experi ment with S9.The polar compounds in frying oil make bone marrow microkernel rate higher to (17.44±0.43)‰,and the relationship isy=3.455 3lnx+22.979.The polar compounds in frying oil can induce mutagenicity.

frying oil,polar compounds,mutagenicity,Ames test,bone marrow microkernel rate

TS225 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)06-0051-05

國家科技支撐計劃(2009BADB9B07)

2009-05-11

劉元法,男,1974年出生,副教授,食用脂質產品的加工技術與深度開發