花生分離蛋白水解物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

黎觀紅樂國偉施用暉

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院1,南昌 330452)

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室2,無錫 214122)

花生分離蛋白水解物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

黎觀紅1樂國偉2施用暉2

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院1,南昌 330452)

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室2,無錫 214122)

利用堿性蛋白酶Alcalase對花生分離蛋白進(jìn)行水解,制備花生分離蛋白水解物,并測定不同水解時間所得產(chǎn)物對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用。未水解的花生分離蛋白沒有ACE抑制活性,而利用堿性蛋白酶Alcalase水解所得的水解物具有很強的ACE抑制活性,水解 30 min時水解物活性最高,其半抑制濃度為(IC50)0.56 mg/mL。通過超濾、Sephadex G-15凝膠過濾層析、反相高效液相色譜 (RP-HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALD I-TOF-MS/MS)和氨基酸組成分析等分析手段從水解 30 min所得的水解物中分離鑒定出兩種新的ACE抑制肽,氨基酸序列為 Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu -Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和 Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser,其 IC50值分別為 10.6μmol/L和36.6μmol/L。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽 花生分離蛋白 堿性蛋白酶 分離純化 質(zhì)譜

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (angiotensin converting en2 zyme,ACE,EC 3.4.15.1)是一種含鋅的二肽羧酶, ACE對機體血壓和心血管功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。ACE催化不具有活性的十肽血管緊張素 I(an2 giotensin I)轉(zhuǎn)化為具有強烈收縮血管作用的八肽血管緊張素 II,ACE能催化具有舒張血管作用及/或降壓作用的舒緩激肽 (bradykinin)的降解[1]。在研發(fā)治療高血壓藥物的過程中,ACE的抑制成為重要的靶標(biāo)。目前,大量高效、特異的ACE抑制劑在治療高血壓病和充血性心力衰竭中發(fā)揮著重要作用。然而,人工合成的ACE抑制劑在臨床應(yīng)用過程中往往會產(chǎn)生不同程度的副作用如咳嗽、味覺功能紊亂及皮疹等[2]。因此,尋找天然的、安全的ACE抑制劑引起了研究者們的極大興趣。來源于食物蛋白質(zhì)的ACE抑制肽 (ACE inhibitory peptide)因其獨特的優(yōu)點引起了人們的極大關(guān)注。試驗表明,這些食物蛋白源ACE抑制肽對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)及高血壓患者具有降壓作用,而對正常血壓大鼠及人無降壓作用[3]。

花生 (Arachis hypogeaeL.)是我國六大油料作物之一,也是第三大重要的植物蛋白資源,花生仁中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 26%～33%之間。我國花生蛋白產(chǎn)量在國內(nèi)各種油料植物蛋白中居第三位,與其他國家相比,僅次于印度而位居第二[4]。利用堿性蛋白酶Alcalase水解花生分離蛋白制備了具有 ACE抑制活性的水解物,通過超濾、Sephadex G-15凝膠過濾層析、反相高效液相色譜 (RP-HPLC)分離、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜 (matrix assistedlaser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALD I-TOF-MS/MS)和氨基酸組成分析等手段從花生分離蛋白 Alcalase水解物中分離鑒定出兩種新的ACE抑制肽,為花生蛋白資源的開發(fā)利用提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

花生仁:產(chǎn)地,江蘇無錫;馬尿酰 -組氨酰 -亮氨酰(Hip-His-Leu)、ACE(活力 3.4U/mg蛋白)、α-氰基 -4-羥基肉桂酸和 Sephadex G-15:Sigma公司;堿性蛋白酶 Alcalase 2.4L FG(紅棕色半透明液體,活力 2.4AU/g,密度 1.18 g/mL,食品級):Novo公司;乙腈 (色譜純):德國 Merck公司;三氟乙酸(TFA):Fluka公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。花生分離蛋白按文獻(xiàn)[5]的方法制備(制備的分離蛋白其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 92.5%)。UV-2102 PSC型紫外可見分光光度計:尤尼柯上海儀器有限公司;CR22G高速大容量冷凍離心機:日本島津公司;UEOS503聚砜中空纖維超濾膜組件 (截留分子質(zhì)量 6000 u):天津膜天膜工程技術(shù)有限公司;FD-1CE冷凍干燥機:北京德天佑科技發(fā)展有限公司;?KTApurifier 100 chromatography systems:瑞典 Amersham Pharmacia生物科技公司;AB I4700型MALD I-TOF質(zhì)譜儀:美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;Ag1100氨基酸專用高效液相色譜儀:美國Agilent公司。

1.2 蛋白質(zhì)水解物的制備

用蒸餾水準(zhǔn)確配制 4.0%的蛋白質(zhì)懸濁液,在9℃下加熱 10 min,而后用高速分散器進(jìn)行均質(zhì)。均質(zhì)液 5℃保溫 10 min,用 2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至 8.0,然后按 20μl/g蛋白的比例加入 Alca2 lase,同時以 0.2 mmol/g蛋白的比例添加 Na2SO3。水解反應(yīng)在夾層玻璃反應(yīng)器中進(jìn)行,反應(yīng)器置于恒溫磁力攪拌器上,水解過程中維持溫度恒定,并用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液維持反應(yīng)體系的 pH值不變,5℃條件下反應(yīng) 10 h。采用 pH-stat法[6]測定反應(yīng)過程中的水解度。分別在反應(yīng)15 min、30 min、45min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h時取樣,所取樣品立即在沸水浴中加熱 10 min滅酶,冷卻,水解物在 4℃,12 000 r/min離心20 min,收集上清液用于ACE抑制活性及蛋白質(zhì)(或肽)濃度的測定。蛋白質(zhì) (或肽)濃度的測定采用 215 nm和 225 nm紫外吸收差法[7]。水解物的ACE抑制活性采用作者以前建立的方法測定[8]。

1.3 ACE抑制肽的分離純化

1.3.1 Sephadex G-15分離純化ACE抑制肽

水解物離心后,利用 UEOS503聚砜中空纖維超濾膜(截留相對分子質(zhì)量為 6 000)超濾上清液,超濾液冷凍干燥。稱取一定量的蛋白質(zhì)水解物凍干粉溶于 pH 4.0,0.02 mol/L HAc-NaAc緩沖液,配成100 mg/mL的溶液,取 1.5 mL溶液上柱 (1.8 cm× 60 cm),用 pH 4.0,0.02 mol/L HAc-NaAc緩沖液以 0.4 mL/min流速洗脫,220 nm檢測。洗脫組分分管收集,每管 2 mL。每個樣品的分離重復(fù) 8次,合并每次分離時相同位置的組分峰,組分峰冷凍干燥。分別測定每個組分峰的ACE抑制活性。

1.3.2 RP-HPLC分離純化ACE抑制肽

取 Sephadex G-15分離純化所得的 ACE抑制活性最高峰凍干粉溶于蒸餾水(含 0.1%TFA),配成5 mg/mL的樣品,樣品經(jīng) 0.45μm微孔濾膜過濾,取濾液上 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離純化。HPLC系統(tǒng):?KTApurifier chromatography systems;色譜柱:Sephasil Peptide C18 12μm ST 4.6/250(4.6 mm×250 mm);上樣量:100μL;流動相 A:含 0.1%TFA的蒸餾水;流動相B:60%乙腈(含 0.1%TFA);洗脫條件:用流動相A和 B梯度洗脫 60 min(0～60 min,0～100% B),流速 1 mL/min,檢測波長 220 nm。每個樣品的分離重復(fù) 10次以上,分管收集單個組分峰,冷凍干燥,并測定ACE抑制活性。將活性最高的組分峰凍干粉溶于蒸餾水(含 0.1%TFA)后上 Sephasil Peptide C18 5μm ST 4.6/250(4.6 mm×250 mm)反相柱再次分離。分離條件為:10%～80%B梯度洗脫40 min,流速 1 mL/min,檢測波長 220 nm。分管收集單個組分峰,冷凍干燥并測定ACE抑制活性。

1.3.3 MALD I-TOF-MS/MS鑒定ACE抑制肽

經(jīng)過兩步RP-HPLC分離純化后的單一活性峰用于MALD I-TOF-MS/MS分析鑒定。活性峰凍干粉用含 0.1%TFA的蒸餾水溶解,基質(zhì)溶液為含有5 mg/mLα-氰基 -4-羥基肉桂酸 (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)及 0.1%TFA的 50%乙腈溶液。質(zhì)譜儀頻率 220 Hz,波長 355 nm;加速電壓20 kV;檢測器電壓 1 kV;反射式陽離子方式檢測。取樣品溶液和基質(zhì)溶液各1μL混合均勻,取1μL混合液用加樣槍點于 192孔不銹鋼 MALD I靶體盤(Applied Biosystems,Framingham,MA,USA)上,溶液干燥后進(jìn)行MALD I-TOF-MS/MS分析。用肌紅蛋白的胰蛋白酶水解物對質(zhì)譜儀進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正。用4700 ExplorerTM軟件 (Applied Biosystems,Framing2 ham,MA,USA)獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析處理,用De novo Explorer軟件 (Applied Biosystems,Framing2 ham,MA,USA)從串連質(zhì)譜數(shù)據(jù)從頭解析 (de novo sequencing)多肽的氨基酸序列,并利用質(zhì)譜解析軟件 Data Explorer(Applied Biosystems,Framingham, MA,USA)對真實譜和理論肽進(jìn)行聯(lián)配 (alignment)以確證從頭解析出的多肽序列。

1.3.4 ACE抑制肽氨基酸組成分析

采用鄰苯二甲醛 (OPA)柱前衍生反相高效液相色譜法測定[9]。樣品加入 6 mol/L的 HCl溶液,真空封口,在 1℃下水解 24 h,冷卻后定容、過濾、蒸干, OPA柱前衍生(脯氨酸與氯甲芴甲酯 (FMOC)反應(yīng))后上Ag1100氨基酸專用高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)水解物的制備

花生分離蛋白的水解進(jìn)程曲線及水解產(chǎn)物的ACE抑制活性如圖 1所示。未水解的蛋白質(zhì)幾乎沒有ACE抑制活性(抑制率1.02%),但經(jīng)過Alcalase水解后蛋白質(zhì)水解物對ACE均顯示不同程度的抑制作用。在同樣濃度條件下對Alcalase酶溶液的ACE抑制活性進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示 Alcalase酶溶液沒有ACE抑制活性。由此說明蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的肽對ACE發(fā)揮了抑制作用,而不是完整蛋白質(zhì)。在水解的初始階段水解物的ACE抑制活性迅速上升,反映了在此階段ACE抑制肽大量產(chǎn)生,水解30min時其水解物活性即達(dá)到最大值,此時相應(yīng)的DH為 14.03%,隨著水解時間的延長其活性逐漸下降。水解 30 min時水解物對ACE半抑制濃度(I C50)為 0.56 mg/mL。

圖1 花生分離蛋白水解進(jìn)程及產(chǎn)物的ACE抑制活性

2.2 ACE抑制肽的分離純化

花生分離蛋白水解 30 min的水解物經(jīng)超濾后,將超濾后的肽混合物經(jīng) Sephadex G-15凝膠柱分離,混合肽被分成 7組分(圖 2 a)。各組分冷凍干燥后,稱取凍干粉用蒸餾水配成濃度為 0.5 mg/mL(肽含量)的溶液用于 ACE抑制活性的測定,結(jié)果見圖2b。由圖 2b可知,經(jīng) Sephadex G-15分離純化后的各組分均具有不同程度的ACE抑制活性,由此說明不同分子量范圍的ACE抑制肽存在于水解物中。其中,組分 C和 E活性具有最大抑制活性。

圖 2 花生分離蛋白水解物 Sephadex G-15凝膠過濾色譜圖(a)及各組分的ACE抑制活性(b)

將 Sephadex G-15分離后的高活性組分 C和 E的凍干粉溶于蒸餾水 (含 0.1%TFA)配成 5 mg/mL的樣品,上 RP-HPLC分離純化。重復(fù)進(jìn)樣,合并每次組分峰,冷凍干燥,測定組分的ACE抑制活性。經(jīng)第一步 RP-HPLC分離后組分 C分離成 15個主要組分(圖 3),組分 E被分離成 18個主要組分(圖 4),其中組分C的 F10及組分 E的 F9活性最高。對圖3的組分 F10及圖 4的組分 F9分別上 Sephasil Peptide C18 5μm ST 4.6/250(4.6 mm×250 mm)反相柱再次純化,結(jié)果分別見圖 5a、圖 5b,經(jīng)二次 RP-HPLC分離后兩組分仍為單一峰。

圖3 組分C的RP-HPLC分離圖譜

圖4 組分 E的RP-HPLC分離圖譜

圖5 二次RP-HPLC分離圖譜

2.3 ACE抑制肽結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 氨基酸組成分析

經(jīng)兩步 RP-HPLC分離所得的單一活性組分完全水解后進(jìn)行氨基酸組成分析,結(jié)果見表 1。

2.3.2 MALD I-TOF-MS/MS解析ACE抑制肽的氨基酸序列

利用MALD I-TOF-MS對經(jīng)兩次 RP-HPLC分離純化后的單一峰分析表明,經(jīng)兩步 RP-HPLC分離所得的單一峰組分均為單一分子離子峰([M+ H]+),說明經(jīng)兩步 RP-HPLC分離純化后所得組分為單一肽。肽Ⅰ和肽 II的 m/z分別為 1404.72和877.48(表 1和圖 6、圖 7),這些母離子經(jīng) TOF-TOF二級質(zhì)譜分析后,得到MS/MS圖譜,如圖 6、圖 7所示,ACE肽的結(jié)構(gòu)信息總結(jié)于表1。在肽QGGSG MT2 LAFPLPK的MS/MS質(zhì)譜圖中出現(xiàn)高豐度的 y型碎片離子峰,而肽段中不含 Pro殘基時,b型碎片離子的豐度明顯增強,這與該碎片離子含有N端 Pro殘基有關(guān),這是因為 Pro的出現(xiàn)常引起 y型碎片離子的豐度增強[10]。同時,在MS/MS圖譜中也出現(xiàn)了 b型和y型離子的脫水、脫氨峰。另外,MS/MS圖譜中還出現(xiàn)了相當(dāng)于氨基酸脫羧或脫氨而產(chǎn)生的特征峰,這些特征峰以m/z=氨基酸分子質(zhì)量 -45或分子質(zhì)量-17為標(biāo)志,這些特征峰對確定肽的氨基酸組成具有重要意義,肽的氨基酸分析結(jié)果與這些特征峰的出現(xiàn)相一致。

表1 ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)表征

圖6 肽 I(m/z 1 403.72)的MS/MS圖譜

圖7 肽Ⅱ(m/z 876.48)的MS/MS圖譜

從大量有關(guān)ACE抑制肽的文獻(xiàn)資料中發(fā)現(xiàn),目前所發(fā)現(xiàn)的 ACE抑制肽都是 2肽～15肽[3,11-13],本實驗從花生蛋白 Alcalase水解物所分離鑒定出來的兩種ACE抑制肽的肽鏈長度亦在此范圍。經(jīng)資料查詢和數(shù)據(jù)庫搜索,這兩種ACE抑制肽為新的ACE抑制肽。

Meisel等對肽的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究結(jié)果表明, ACE抑制肽 C末端氨基酸 Arg和 Lys的側(cè)鏈胍基或ε-氨基對其活性有很大的貢獻(xiàn)[14]。計算機輔助分子建模對肽結(jié)構(gòu)的理論研究結(jié)果表明,抑制劑能與不被底物所占有的亞活性位點或不同于ACE催化部位的陰離子抑制劑結(jié)合位點相互作用。ACE抑制肽的分子靜電勢模式不同于無活性分子:即ACE抑制肽中相似的正電勢幾乎位于 C末端的相同區(qū)域[14]。QGGSG MTLAFPLPK的 C末端氨基酸符合上述特征。有些研究者從乳清蛋白或酪蛋白的酶解物中分離鑒定出 C末端為 Lys或 Arg的高活性 ACE抑制肽[15-16]。肽的疏水性也是影響其活性的重要因素[17]。高親水性無法使肽接近 ACE活性部位而導(dǎo)致弱或無活性。這兩種ACE抑制肽含有高含量的疏水性氨基酸,高疏水性有利于肽與ACE的結(jié)合。

3 結(jié)論

利用堿性蛋白酶 Alcalase對花生分離蛋白進(jìn)行水解可制備具有ACE抑制活性的花生分離蛋白水解物,水解 30 min時水解物活性最高,水解物對其半抑制質(zhì)量濃度為 (I C50)0.56 mg/mL。隨著水解時間的延長水解物活性逐漸下降。通過超濾、Sephadex G-15凝膠過濾層析、RP-HPLC分離、MALD I-TOFMS/MS和氨基酸組成分析等手段從花生分離蛋白Alcalase水解物 (水解 30 min)中分離鑒定出兩種新的ACE抑制肽,其氨基酸序列為 Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser,其I C50值分別為 10.6μmol/L和 36.6μmol/L。

[1]Johnston J I,Franz VL.Renin-angiotensin system:a dual tissue and hor monal system for cardiovascular control[J]. Journal of Hypertension,1992,10:S13-S26

[2]Messerli FH.Hypertension and sudden cardiac death[J]. American Journal of Hypertension,1999,12:86S-90S

[3]Li GH,Le G W,Shi YH,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J].Nutrition Research,2004,27:469-486

[4]劉大川,張維農(nóng),胡小泓.花生蛋白制備工藝和功能特性的研究 [J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2001,(4):1-10

[5]王瑛瑤,王璋.水酶法從花生中提取蛋白質(zhì)與油 -堿提取工藝研究 [J].食品科技,2002,(7):6-8

[6]Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. Lond:ElsevierApplied Science Publishers,1986:57-109

[7]Murphy JB,KiesMW.Note on spectrophotometric determi2 nation of proteins in dilute solutions[J].Biochimica Bio2 physica Acta,1960,45:382-384

[8]Li GH,Liu H,Shi YH,et al.Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity for screening bioactive peptides[J].Journalof Phar2 maceutical and BiomedicalAnalysis,2005,37:219-224

[9]牟德海.OPA柱前衍生反相高效液相色譜法測定氨基酸含量 [J].色譜,1997,15(4):319-321

[10]Papayannopoulos A I.The interpretation of collision-in2 duced dissociation tandem mass spectra of peptides[J]. Mass Spectrometry Review,1995,14:49-73

[11]Dziuba J,Minkiewicz P,NaleczD,et al.Database of bio2 logically active peptide sequences[J].Nahrung/Food, 1999,43:190-195

[12]黎觀紅,樂國偉,施用暉,等.利用自建的活性肽數(shù)據(jù)庫搜尋食物蛋白質(zhì)中潛在的生物活性肽 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(1):85-88

[13]Nakamura Y,Yamamoto M,Sakai K,et al.Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from a sourmilk[J].Journal of Dairy Science, 1995,78:777-783

[14]Meisel H.Biochemical properties of bioactive peptides de2 rived from milk proteins:Potential nutraceuticals for food and phar maceutical applications[J].Livestock Production Science,1999,50:125-138

[15]Pihlanto-Lepp?l?A,Koskinen P,Piilola K,et al.Angio2 tensin-I converting enzyme inhibitory properties of whey protein digests:Concentration and characterization of active peptides[J].Journal ofDairy Research,2000,67:53-64

[16]Tauzin J,Miclo L,Gaillard J-L.Angiotensin-I-conver2 ting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovineαs2-casein[J].FEBSLetters,2002,531:369-374

[17]KohmuraM,Nio N,Kubo K,et al.Inhibition of angioten2 sin-converting enzyme by synthetic peptidesof humanβcasein[J].Agricultural and Biological Chemistry,1989, 53:2107-2114.

Isolation,Purification and Identification of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Peanut Protein Isolate Hydrolysate

Li Guanhong1Le Guowei2Shi Yonghui2
(College ofAnimal Science and Technology,JiangxiAgriculturalUniversity1,Nanchang 330045)
(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University2,Wuxi 214122)

Peanutprotein hydrolysateswere prepared by enzymatic hydrolysiswithAlcalase,and the angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory activities of the hydrolysateswere investigated at different hydrolysis time.Re2 sults:The unhydrolyzed protein exhibits no inhibitory activity.Hydrolysates generated with Alcalase exhibit high in2 hibitory activity.The highestACE inhibitory activitywith IC50 value of 0.56 mg protein/ml is found in the hydroly2 sate obtained with Alcalase hydrolysis time of 30 min.Two kinds of novelACE inhibitory peptideswere isolated from the Alcalase hydrolysate by ultrafiltration,Sephadex G-15 and reverse-phase high perfor mance liquid chromatogra2 phy.The amino acid lists of these novel peptides identified by amino acid composition analysis and matrix assistedlaser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry are Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys and Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Serwith I C50value of 10.6μM and 36.6μM,respectively.

angiotensin converting enzyme inhibitory peptides,peanut protein isolates,Alcalase,isolation and purification,mass spectrum

TS201 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)06-0056-06

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)“未來之星”培養(yǎng)計劃(20090206)

2009-04-16

黎觀紅,男,1974年出生,博士,副教授,糧食、油脂及植物蛋白工程

樂國偉,男,1956年出生,博士生導(dǎo)師,教授,食品營養(yǎng)與安全