醬油曲霉發酵芝麻餅粕中抗氧化物質提取條件的優化

邵元龍 董 英

(江蘇大學食品與生物工程學院,鎮江 212013)

醬油曲霉發酵芝麻餅粕中抗氧化物質提取條件的優化

邵元龍 董 英

(江蘇大學食品與生物工程學院,鎮江 212013)

采用正交設計和響應面的試驗方法,對醬油曲霉發酵芝麻餅粕中的抗氧化物質的提取工藝進行了優化。結果表明,正交優化試驗中,影響提取發酵芝麻餅粕中抗氧化物質因素的主次順序為:乙醇體積分數 >液料比 >提取時間 >提取次數。通過響應面試驗再優化,得到影響提取抗氧化物質因素的二次多項式數學模型方程為:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2。優化的提取條件為:提取時間 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分數 61.3%,在此條件下,DPPH自由基清除率可達 81.5%。該結果為下一步對提取的抗氧化物質的分離和發酵機制的研究奠定了基礎。

芝麻餅粕 醬油曲霉 優化 提取 抗氧化物質

在亞洲國家,芝麻廣泛應用在各種傳統食品中,并且是世界上重要的油料作物之一,我國 2007年的產量已達到59萬噸。上世紀 90年代,逐漸重視芝麻中木脂素類物質的研究,這類物質是重要的抗氧化劑,具有多種生理功能[1-3]。木脂素約占芝麻的0.5%～1.0%,分為脂溶性和水溶性兩類,如芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚等[4-9]。在提油過程中,部分木脂素轉移到芝麻餅粕中,其提取方法和生理活性一直是研究的熱點[10]。

單純的分離和鑒定木脂素已不能滿足未來對抗氧化劑的需求,應用現代生物技術方法尋找新抗氧化劑來源前景廣闊。董英等[11]用醬油曲霉發酵芝麻餅粕,發現可以提高其抗氧化活性,對其提取條件并未深入探討。因此,本試驗仍選用該菌株對芝麻餅粕進行發酵,以抗氧化活性為指標,對提取條件再優化,為下一步對發酵芝麻餅粕中抗氧化物質的分離純化和轉化機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

醬油曲霉 (Aspergillus sojae),CI CC 2128:中國工業微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕:江蘇鎮江京友調味品公司[12];二苯代苦味肼基自由基 (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):美國 Sigma公司。

HH-S恒溫水浴鍋:江蘇金壇醫療儀器廠; Y M50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫療器械有限公司;PSX智能型恒溫恒濕培養箱:寧波來福科技有限公司;WFJ-7200可見分光光度計:尤尼柯 (上海)儀器有限公司。

1.2 接種與發酵方法

醬油曲霉接種于土豆汁 (PDA)斜面培養基上, 28℃培養 72 h后,加入 10 mL無菌生理鹽水,用接種針刮下,調節菌液濃度為 0.86×108cfu/mL。取烘干粉碎的芝麻餅粕,按料液比為 1:3的比例加入正己烷,45℃水浴攪拌 3 h,4 000 r/min離心 10 min,沉淀自然晾干,得脫脂芝麻餅粕。取 10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9 mL蒸餾水,于121℃滅菌20 min,冷卻后,接種 1 mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發酵 144 h,72 h時搖勻一次,直至發酵結束。

1.3 提取工藝優化方法

1.3.1 正交優化試驗設計

在多次單因子對比試驗基礎上,選擇提取溶劑乙醇體積分數(A)、提取時間 (B)、總乙醇體積與芝麻餅粕質量比(液料比)(C)和提取次數 (D)4個因素,考察 4因素對自由基清除率的影響,試驗因素水平見表 1。發酵結束后,按試驗設計方案加入提取液,于 50℃水浴攪拌提取,轉速 150 r/min。提取液于 5 000 r/min離心 10 min。上清液經濃縮或添加提取液,統一定容至 150 mL。對提取液的自由基清除率進行測定和分析。

表1 正交試驗設計因素水平表

1.3.2 響應面優化試驗設計

在探討了乙醇體積分數、提取時間、液料比和提取次數對提取物抗氧化活性影響的基礎上,優化出 3個主要的影響因素。根據 Box-Behnken中心組合試驗設計原理,以提取時間、液料比、乙醇體積分數為自變量,自由基清除率為響應值,對這 3個因素進一步優化,設計了三因素三水平的響應面分析試驗,試驗的因素和水平取值見表 2。發酵條件和提取液處理條件與正交試驗一致。

表2 響應面試驗因素水平表

1.3 DPPH自由基清除率測定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的發酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀釋10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長 517 nm,50%乙醇為對照。每個樣品重復測定 2次,求平均值。

計算公式為:

式中:A0為 5 mL DPPH與 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai為 5 mL DPPH與 1 mL樣品反應后的吸光度;Aj為 5 mL乙醇與 1 mL樣品混合液的吸光度[13]。

2 結果和討論

2.1 正交優化試驗結果

從表 3可知,影響抗氧化物提取率因素的主次為A>C>B>D,即乙醇體積分數對提取率影響最大,其次為液料比和提取時間,最弱的為提取次數。乙醇體積分數為 60%時,提取物的平均自由基清除率為71.46%,大于 80%時的平均清除率為 69.02%,但無顯著的差異,提取次數之間差異微弱。從提取過程可操作性及經濟學考慮,提取溶液體積和濃度,都應盡可能減小,且采用單次提取。

表 3 正交試驗設計L9(34)及結果

2.2 響應面優化試驗結果

響應面試驗設計和結果見表 4,對所得數據采用Desigh-Expert 7.0 Trial軟件中的 RS(response sur2 face)程序進行分析,應用Model Graph程序作響應曲面圖和等高線圖。

表4 響應面試驗設計和結果

經回歸擬合,獲得Aspergillus發酵芝麻餅粕提取物抗氧化活性對自變量提取時間、液料比和乙醇體積分數的二次多項回歸方程為:

RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

模型方差分析見表 5,試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P<0.000 1),失擬項不顯著(P =0.075 3)。所以自由基清除率與預測值之間具有較好的擬合優度,可用于Aspergillus固體發酵提取物抗氧化活性的分析和預測。從 3個因素對提取物抗氧化活性的影響來看,回歸方程的一次項中B和 C對發酵提取物抗氧化活性的影響極顯著(P<0.01),且影響能力B>C,即液料比 >乙醇體積分數,提取時間的線性影響不顯著,各因素二次項A2、B2和 C2的影響也達到了極顯著水平,交互作用項中僅 AC達到了顯著(P<0.05)的水平。這也表明了響應值的變化復雜,不僅受單因素的影響,而且還存在交互作用。

表5 響應面試驗設計方差分析表

對回歸方程進行數學分析,可得到最大響應值所對應的提取條件,擇優的提取條件為:提取時間120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分數 61.3%,理論提取物抗氧化活性為 82.5%。為了驗證該結果,按照該條件做 5次驗證試驗,結果分別為 79.24%、81.18%、82.39%、83.47%和 81.33%,平均值為81.5%,與理論值差異不顯著,優化的結果有意義。

2.3 響應面的等高線圖和曲面圖

通過二次回歸方程所作的響應曲面圖及等高線圖如圖 1和圖2。

圖 1 時間和乙醇體積分數交互作用的等高線圖及其曲面圖

圖 2 液料比和乙醇體積分數交互作用的等高線圖及其曲面圖

圖 1顯示了提取時間和乙醇體積分數對提取物抗氧化能力的影響效應。由圖可知,兩因素之間存在較強的交互作用,在試驗條件范圍內,隨著提取時間的延長,乙醇體積分數的提高,提取物抗氧化活性迅速提高,達到一定值后,又明顯下降。由圖 2可知,乙醇體積分數和液料比均趨向于較大取值點時抗氧化活性較高。而時間和料液比的相互作用對提取物抗氧化能力的影響不顯著。

3 結論

3.1 通過正交優化試驗得出,影響從醬油曲霉發酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質的各因素的主次順序為:A>C>B>D,即乙醇體積分數對提取率影響最大,其次為液料比和提取時間,最弱的為提取次數。3.2 利用 Design expert設計軟件,采用響應面分析法建立了從醬油曲霉發酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質的提取工藝條件的二次多項式數學模型,并對各因素對響應值的影響進行了分析。擬合的考察因素與抗氧化活性之間的二次回歸方程為:RSA=82.22+ 0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,用該方程獲得預測值與實際值擬合度高。優化的提取條件條件為:提取時間 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇體積分數61.3%,在此條件下,發酵提取物的抗氧化活性可達81.5%。

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Optimizing Extraction Conditions ofAntioxidantion Material inAspergillus sojaeFer mented SesameMeal

Shao Yuanlong Dong Ying
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013)

Orthogonal design and response surface methodologywere applied to optimize the extraction technolo2 gy of antioxidantmaterial from sesame meal fer mentated byAspergillus sojae.Results:The effects of the infuencing factors for the antioxdation material extraction rank as ethanol volume fraction>ratio of solution to material>time> extraction times in orthogonal design.The regression quadratic equation of RS M to re-optimization experiment fac2 tors influencing the extraction of antioxidantion materials is:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,The optimum extraction conditions are time 6h,ratio of solution to material 15.7 mL/g and ethanol volume fraction 61.3%.TheDPPH radical scavening capacity is 81.5%in the pres2 ent experiment.

sesame meal,Aspergillus sojae,optimization,extraction,antioxidantmaterial

TS201 文獻標志碼:A 文章編號:1003-0174(2010)06-0062-04

江蘇省科技攻關項目(BE2005335)

2009-01-09

邵元龍,男,1977年出生,博士,生物資源的深度開發與利用

董英,女,1954年出生,教授,博士生導師,生物化學